脱氢紫堇碱对高糖培养心肌成纤维细胞Wnt信号通路的影响

脱氢紫堇碱对高糖培养心肌成纤维细胞Wnt信号通路的影响

韩路拓1，2，任钧国1*，刘建勋1，王伟明2，杨佳妹1，刘馨雨1

(1.中国中医科学院西苑医院基础医学研究所中药药理北京市重点实验室，北京 100091;

2.黑龙江省中医药科学院，哈尔滨 150036)

摘要：目的采用体外高糖培养心肌成纤维细胞(CFs )的方法，观察脱氢紫堇碱(DHC)对高浓度葡萄糖培养的心肌成纤维细胞Wnt信号通路的影响。方法采用体外高糖诱导心肌成纤维细胞增殖模型, western blot法检测β-catenin,GSK-3β以及P-GSK-3β的蛋白表达水平；ELISA法观察细胞分泌TGF-β1蛋白的能力。结果脱氢紫堇碱可以抑制β-catenin的表达(P<0．01),上调P-GSK-3β的表达(P <0．05)，减少TGF-β1的合成(P <0．01)。结论脱氢紫堇碱能抑制Wnt信号通路的异常表达，具有潜在的抗心肌纤维化作用。

关键词：脱氢紫堇碱；高糖；心肌成纤维细胞；Wnt信号通路

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.11.025

中图分类号：R542.2文献标志码： A

基金项目：国家自然科学基金资助项目(H2809)。

作者简介：韩路拓(1986-)，女，硕士，主要从事细胞药理学研究。

收稿日期:(责任编辑：张瑞彬2014-12-21)

*通信作者：任钧国，电子信箱-reek2003@163.com

Dehydrocorydaline on Wnt signal pathway of cardiac fibroblasts cultured by high glucose

HAN Lutuo1,2, REN Junguo1*，LIU Jianxun1，WANG Weiming2, YANG Jiamei1, LIU Xinyu1

(1.Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital China Academy of Chinese Medical Sciences，

Beijing Key Laboratory of Pharmacology of Chinese Materia, Beijing 100091 , China;

2.Traditional Chinese Medicine Institute of Heilongjiang Chinese Medicine Academy of Sciences,

Harbin 150036, China)

Abstract：ObjectiveTake the method of cultured cardiac fibroblasts (CFs) in vitro, to observe the effect of Dehydrocorydaline on high glucose cultured cardiac fibroblasts of Wnt signal pathway. MethodsBy the cardiac fibroblasts model in vitro induced by high glucose, detection of the expression level of β-catenin, GSK-3β, P-GSK-3β by western blot; to observe the ability of the cell TGF-β1 protein secretion by ELISA method . ResultsDehydrocorydaline can inhibit the expression of β-catenin (P<0.01), upregulate the expression of P-GSK-3β (P <0.05), reduction of the synthesis of TGF- β1 (P <0.01). ConclusionDehydrocorydaline can inhibit of abnormal expression of Wnt signaling pathway , have potential effects of anti myocardial fibrosis.

Keywords：Dehydrocorydaline; high glucose; cardiac fibroblasts; Wnt signal pathway

糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病最常见的心血管并发症之一，心肌物质和能量代谢改变，是糖尿病心肌病发生的重要环节[1]，心肌纤维化是其病变的关键[2]。研究表明，Wnt信号通路在心脏发育和血管生成中有重要作用，在心脏发育早期，Wnt信号通路的激活可以促进心脏祖细胞增殖和迁移，在心脏发育晚期，抑制其活性则可促进心肌细胞分化[3]。因此，抑制Wnt信号的异常激活，可作为防治糖尿病心肌纤维化的一个手段。 延胡索，又名元胡，是一种临床常用中药，其现代药理作用研究主要集中于心血管系统和神经系统。延胡索的主要活性成分为生物碱类，脱氢紫堇碱(DHC)又称去氢延胡索甲素，是其中的一种季胺类生物碱。笔者前期实验研究已表明，脱氢紫堇碱干预高糖培养的心肌成纤维细胞后，对细胞的增殖、细胞S期分裂都有明显抑制作用，还可以明显降低I型、Ⅲ型胶原的分泌能力[4]。为进一步研究其作用机制，本实验采用体外高糖培养的心肌成纤维细胞模型，观察脱氢紫堇碱对心肌成纤维细胞Wnt信号通路的影响。

1实验材料

1.1实验动物SD大鼠乳鼠20只，出生24 h内，SPF级,雌雄不限,购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：11400700012085，11400700019526。

1.2主要试剂和仪器胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶均为Sigma公司进口分装产品。脱氢紫堇碱对照品(北京鑫方程生物公司,批号120930,20 mg)，卡托普利对照品(中国食品药品检定研究院，批号100318-201103，100 mg)。TGF-β1 ELISA试剂盒(美国RD公司)，小鼠抗波形蛋白单克隆抗体和小鼠抗结蛋白单克隆抗体(Biogenes公司)，PVDF膜(北京智杰方远科技有限公司)，ECL发光液(美国赛默飞世尔科技有限公司)。DMEM高糖培养基，DMEM低糖培养基和胎牛血清(FCS)均为GIBCO公司产品。兔抗大鼠-catenin单克隆抗体，兔抗大鼠-GSK-3β单克隆抗体，兔抗大鼠-P-GSK-3β单克隆抗体，兔抗大鼠GAPDH多克隆抗体及羊抗兔多克隆抗体均为美国abcam公司产品。酶联免疫分析仪(美国BioTek公司)，Western成像系统(美国伯乐公司)。其他常用生化试剂均为国产分析纯。

2实验方法

2.1差速贴壁法体外培养心肌成纤维细胞及鉴定参照 SREEJIT P等[5]的方法加以改进,取出生24 h内的SD大鼠乳鼠，无菌条件下，开胸后快速摘取心脏，浸泡在预冷的0．01% 磷酸盐缓冲液中，以除去血细胞。75% 的酒精浸泡30 s后，将其剪成1 mm3大小的碎块，弃去缓冲液，加入等体积的0．1%的Ⅱ型胶原酶和0．125%的胰蛋白酶，于37 ℃水浴反复振荡消化，直至组织块消化完全，分别收集每次的消化悬液。用含10%FCS的DMEM低糖培养液来终止消化，将收集的消化悬液离心(2 000 r/min，10 min)，上清弃去，再加入含10% FCS的DMEM低糖培养基，吹打成细胞悬液，接种至培养瓶，于37 ℃、5%CO2培养箱内培养。根据心肌成纤维细胞(CFs)和心肌细胞贴壁时间的不同，采用差速贴壁分离法，贴壁60 min后弃上清，剩下的则应为CFs，加入含10% FCS的DMEM低糖培养液继续培养。经免疫组化鉴别，波形蛋白染色呈阳性和结蛋白染色为阴性，判断所得细胞为所需的心肌成纤维细胞，纯度达98%，台盼兰染色细胞活力大于90%。待80%～90%细胞融合后，用0．25%胰酶消化传代(1∶2)，实验采用2～4代细胞。

2.2实验分组将心肌成纤维细胞分为正常对照组：DMEM低糖培养基(内含5．5 mmol/L D-葡萄糖)，模型对照组：DMEM高糖培养基(内含25 mmol/L D-葡萄糖)，脱氢紫堇碱组(100、50 mg/L)，卡托普利组(22 mg/L)。

2.3ELISA法检测TGF-β1蛋白含量取CFs制成细胞悬液，按 1×105个/mL的细胞密度接种于6孔板，37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，换无血清DMEM同步化24 h，按实验分组处理后，培养48 h分别吸取细胞上清液，严格按照试剂盒说明检测TGF-β1的含量，450 nm处检测吸光度(A)，根据浓度曲线，计算每孔内蛋白浓度。

2.4Western-blot法检测β-catenin, GSK-3β, P-GSK-3β的蛋白表达细胞总蛋白的提取：取分组处理培养后的心肌成纤维细胞，加入蛋白裂解液，置于冰浴上30 min，细胞刮刀刮取裂解液，离心(2 000 r/min，30 min)后，收集上清液，紫外分光光度仪检测蛋白含量，根据标准曲线计算样本浓度；调整浓度后，加入上样缓冲液，蛋白煮沸3 min后，置于-80 ℃冰箱保存备用。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：经电泳分离蛋白后，将蛋白转移至PVDF膜上，含5%牛血清白蛋白的TBST室温封闭30 min后，一抗孵育20 min，4 ℃冰箱过夜。复温后，洗膜5×10 min/次，封闭30 min，加二抗封闭90 min后，洗膜5×10 min/次，加入ECL发光液，于成像系统曝光、采集图像。

3实验结果

3.1乳鼠心肌成纤维细胞的培养与鉴定 乳鼠心肌成纤维细胞增殖明显，2～3 d即呈融合状态。细胞多呈长梭形，多角形，排列紧密，胞体较大，细胞质透明，细胞核呈椭圆形，颜色淡，通常含 2～3个核，无自发性搏动。波形蛋白免疫荧光鉴别显示，心肌成纤维细胞的波形蛋白呈阳性反应，结蛋白呈阴性反应。

3.2脱氢紫堇碱对TGF-β1分泌的影响见表1。结果显示，与正常对照组比较，高糖可以明显诱导心肌成纤维细胞合成分泌TGF-β1(P<0．01)。与模型对照组比较，卡托普利和100、50 mg/L脱氢紫堇碱均可明显抑制TGF-β1的合成分泌(P<0．01)。

表1　 脱氢紫堇碱对TGF-β1合成的影响

注：与正常对照组比较,##P< 0．01，与模型对照组比较,△△P<0．01

3.3脱氢紫堇碱对β-catenin及P-GSK-3β蛋白表达的影响见表2。结果显示,与正常对照组比较，高糖可以诱导心肌成纤维细胞β-catenin 表达升高(P<0．05)，下调P-GSK-3β蛋白的表达(P<0．05)。与模型对照组比较，100、50 mg/L脱氢紫堇碱可明显抑制β-catenin的表达(P<0．01)，100 mg/L 脱氢紫堇碱可明显增加P-GSK-3β的表达上调(P<0．05)，50 mg/L脱氢紫堇碱对P-GSK-3β的表达无统计学意义(P>0．05)；卡托普利可以抑制β-catenin的表达(P<0．05)，对P-GSK-3β的作用差异无统计学意义 (P>0．05)。

组 别浓度/(mg/L)β-catenin蛋白/(ROD)P-GSK-3β蛋白/(ROD)正常对照组 —0.312±0.063 0.428±0.048 模型对照组 —0.482±0.052# 0.265±0.074#脱氢紫堇碱组1000.140±0.015△△0.467±0.043△ 500.224±0.025△△0.243±0.121 卡托普利组 220.253±0.014△△0.473±0.151

注：与正常对照组比较#P< 0.05，与模型对照组比较△P< 0．05, △△P<0．01

4讨论

糖尿病心肌病在持续高糖的始动因素[6]作用下，导致外周血中血管紧张素Ⅱ增多[7]，心脏间质Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解异常[8]，降低单核细胞趋化因子的活化及表达[9]，在此过程中出现心肌细胞外基质的大量沉积，这些可能与心肌纤维化有着非常密切的关系。近些年，中医和中西医结合治疗该病的研究比较深入，取得了很多有价值的成果[10-12]。

延胡索是活血化瘀药的代表药，味辛、苦，性温，归心、肝、脾经，功效为活血、行气、止痛，临床多用于气血瘀滞痛证，跌打损伤；且还有镇痛，镇静，催眠作用。现代药理研究表明其主要作用于心血管系统，药效物质为生物碱类成分，DHC为主要有效成分。研究[13]表明DHC具有减轻心肌缺血再灌注损伤，扩张冠状动脉，降低耗氧量，抑制血小板聚集，改善微循环等药理作用[14]。在前期实验的基础上，本实验采用体外高糖诱导的心肌成纤维细胞模型，观察脱氢紫堇碱对于心肌成纤维细胞TGF-β1蛋白表达及Wnt通路的影响，来探讨脱氢紫堇碱防治糖尿病心肌纤维化的作用机制。TGF-β1是最重要的促进纤维化生长的因子，具有多功能的细胞间信号转导功能，在细胞外基质合成、识别、增殖、凋亡及特殊分化中发挥了重要作用[15]。TGF-β1能够促进心肌成纤维细胞合成纤维蛋白及Ⅰ、Ⅲ型胶原等，增加了心肌组织细胞外基质的合成，抑制了胶原降解，同时也是各种因素致心肌纤维化的共同通路[16]。

Wnt/β-catenin信号通路是调控细胞生长和增殖的重要途径，Wnt信号通路的异常激活可以导致纤维增生等疾病的发生，在Wnt信号经典通路Wnt/β-catenin中，β-catenin处于中心位置，是一种多功能的胞浆蛋白，参与细胞的黏附、迁移及上皮间质的转化、生长、分化、凋亡等过程，从而在胚胎发育、内环境稳定和器官形成等诸多方面起到重要作用[17]。而GSK-3β等是负向调节因素，通过GSK-3β的磷酸化及泛素蛋白酶体系统进而降解，使之游离在胞浆保持较低浓度，无法转运到细胞核内产生生物学效应[18]，GSK-3β通过抑制Wnt通路，调节细胞的增殖、分化和凋亡[19]。β-catenin在细胞内的数量和状态对该途径有决定性影响，因此被认为是该信号途径激活的标志[20]。

本实验研究发现，该成分作用于高糖培养的心肌成纤维细胞后，能够降低TGF-β1的分泌，表明脱氢紫堇碱不仅能够抑制心肌成纤维细胞的增殖，还可以降低其合成与分泌蛋白的能力，进而能够抑制糖尿病心肌纤维化。实验研究也表明，在分子水平上，高糖可以上调β-catenin的表达，抑制P-GSK-3β的高表达。说明高糖环境下，两条通路之间可能存在一定的相互作用。实验结果显示脱氢紫堇碱可以抑制β-catenin的表达，上调P-GSK-3β的异常表达，说明该成分能够阻断Wnt/β-catenin信号通路；同时该成分可以抑制TGF-β1蛋白的表达水平，说明脱氢紫堇碱可能同时能够抑制TGF-β1通路的转导。

综上所述，脱氢紫堇碱是一种具有潜在治疗糖尿病心肌纤维化的有效成分，有关其深入的作用机制值得进一步研究，为糖尿病心肌纤维化的防治提供指导。

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