电喷雾质谱法研究不同碳链长度的全氟羧酸与肌红蛋白的相互作用

李志雄,王　献

(中南民族大学化学与材料科学学院,湖北 武汉430074)

电喷雾质谱法研究不同碳链长度的全氟羧酸与肌红蛋白的相互作用

李志雄,王献

(中南民族大学化学与材料科学学院,湖北 武汉430074)

摘要：采用电喷雾质谱法(ESI-MS)检测了全氟丁酸、全氟己酸、全氟辛酸和全氟癸酸分别与肌红蛋白的相互作用，通过直接计算法测定了4种全氟羧酸与肌红蛋白的结合常数，并研究了碳链长度对全氟羧酸类化合物与肌红蛋白相互作用的影响。结果表明，不同碳链长度的全氟羧酸类化合物与肌红蛋白相互作用的能力有差别， 碳链越长，其结合能力越强，且与蛋白质结合的配体数目越多。

关键词：肌红蛋白;电喷雾质谱;全氟丁酸;全氟己酸;全氟辛酸;全氟癸酸;结合能力

全氟化合物是一种新型持续性有机污染物，作为一种广泛应用于纺织品、灭火剂、化妆品、药品、包装材料等工业领域的物质[1]，其环境危害直至近十几年来才被发现并引起广泛关注。由于全氟化合物中含有大量的C-F键，使得其性质十分稳定，高热、强酸碱、超声、生物降解均无法将其分解[2]，因此其可以在空气、水、土壤中长时间、长距离地扩散，而且还可以通过食物链在生物体内富集[3-4]，在世界范围内的大量生物体内都已经检测出全氟化合物的存在[5]，已有研究报告称在人体血液中检测出全氟化合物，此外，母乳、肝脏中也检测到不同浓度的全氟化合物[6]。由于全氟化合物在血液中大量富集，有可能被血液运载到人体不同的器官及组织(包括肌肉组织)，其生物过程和毒性机制是目前的研究热点之一。全氟辛酸是全氟化合物中应用最为广泛的一种，已被列入斯德哥尔摩公约。根据碳链长度的不同，全氟羧酸同系物还包括全氟丁酸、全氟己酸、全氟癸酸等。

电喷雾质谱法(ESI-MS)是一种软电离技术，近年来被广泛应用于蛋白质与小分子间的非共价键相互作用研究，具有灵敏度高、方便快捷、样品用量小等优点，而且能够从谱图获得蛋白质复合物的化学计量比[7-11]。肌红蛋白是一种氧结合血红素蛋白，主要分布于心肌和骨骼肌组织，由一条肽链和一个血红素辅基组成，是肌肉内储存氧的蛋白质。肌红蛋白作为质谱中常用的模型蛋白，其峰型好且信号稳定。

全氟化合物与肌红蛋白的相互作用研究有助于进一步探明其毒性机理及体内危害。作者采用电喷雾质谱法研究了全氟丁酸、全氟己酸、全氟辛酸、全氟癸酸与肌红蛋白之间的相互作用，计算了这4种全氟羧酸与肌红蛋白的结合常数，比较了结合能力的大小，研究了全氟羧酸碳链长度对相互作用的影响。

1实验

1.1　试剂与仪器

肌红蛋白(Mb，纯度>99.8%)、全氟癸酸(纯度>98%)，Sigma公司；全氟辛酸(分析纯)、全氟己酸(纯度≥98%)、全氟丁酸(纯度≥98%)，阿拉丁试剂有限公司；甲醇、乙腈(色谱纯)，美国Waltman公司；超纯水(18.25 MΩ)。

Agilent 1200型高效液相色谱仪、Agilent 6520 Q型四极杆飞行时间质谱仪(TOF-MS)，美国安捷伦科技有限公司；Molelement 1815a摩尔元素型超纯水机，上海摩勒科学仪器有限公司。

1.2　溶液配制

称取一定量乙酸铵配制成 pH=7.4的缓冲溶液备用。称取一定量的肌红蛋白用乙酸铵缓冲溶液配制成浓度为100 μmol·L-1的溶液，存于-20 ℃下备用。称取一定量的全氟丁酸、全氟己酸、全氟辛酸、全氟癸酸用乙酸铵缓冲溶液分别配制成浓度为100 μmol·L-1的溶液，存于4 ℃下备用。确定蛋白质的终浓度为2.5 μmol·L-1，不同物质的量浓度比的溶液配制见表1。混合溶液配制好后在37 ℃恒温下孵育45 min后开始进行质谱检测。

表1 不同物质的量浓度比的蛋白质-小分子混合溶液的配制/μLTab.1　Preparation of different molar ratios of protein-molecule mixture solutions/μL

1.3　色谱-质谱条件

在ESI-Q-TOF-MS的正离子模式下进行全氟羧酸与肌红蛋白相互作用的检测，待测样品由自动进样器以标准进样方式进样，不采用色谱柱分离而是将待测液直接由流动相送至质谱仪中。为了防止有机流动相引起的肌红蛋白与全氟羧酸的复合物解离，液相色谱的流动相为100%的超纯水，流速设定为0.05 mL·min-1，进样量为30 μL。电喷雾质谱的条件：干燥气温度为175 ℃；干燥气流速为7 L·min-1；喷雾器压力为13.8 kPa；毛细管电压为3 500 V；碎裂电压为125 V；质谱采集范围为600~3 200m/z。

2结果与讨论

2.1　不同全氟羧酸与肌红蛋白相互作用的ESI-MS分析

图1为与全氟丁酸、全氟己酸、全氟辛酸、全氟癸酸与肌红蛋白相互作用的ESI-MS图谱。

图1　全氟丁酸(a)、全氟己酸(b)、全氟辛酸(c)、全氟癸酸(d)与肌红蛋白相互作用的ESI-MS图谱Fig.1　The ESI-MS spectra of the interaction between heptafluorobutyric acid(a),undecafluorohexanoic acid(b),perfluorooctanoic acid(c),nonadecafluorodecanoic acid(d) and myoglobin

由图1可知，在+8及+9多电荷峰处4种全氟羧酸化合物与肌红蛋白均出现明显的复合物峰，但是强度不同。同种全氟羧酸分子与肌红蛋白结合复合物峰的数量随着物质的量浓度比的增大而不断增加；在一定物质的量浓度比下，复合物峰的数量随着全氟羧酸碳链的增长而增加。

2.2　不同全氟羧酸与肌红蛋白相互作用的结合常数

通过质谱去卷积谱图中蛋白质以及复合物峰的信号强度，采用下列公式计算4种全氟羧酸化合物与肌红蛋白的结合常数[8,10,12-13]：

(1)

(2)

式中：Rj为已结合的复合物与未结合的蛋白质的浓度比；Kaj为肌红蛋白与全氟羧酸的结合常数；[L] 为溶液平衡态时的自由小分子浓度,可以表达成式(3)：

(3)

式中：[P0]为总的蛋白质浓度，[L0]为总的小分子浓度。所以式(3)又可写成为式(4)：

(4)

由于复合物浓度以及蛋白质浓度均与质谱图中离子的信号强度成正比，故其浓度比可以由去卷积谱图中相应峰的丰度比来表示，代入式(4)即可计算得到不同物质的量浓度比时的结合常数，见表2。

表2　4种全氟羧酸与肌红蛋白相互作用的结合常数/(L·mol-1)Tab.2　Binding constants of four perfluoroalkyl acids interacting with myoglobin/(L·mol-1)

由表2可知，4种全氟羧酸均能与肌红蛋白发生相互作用，虽然全氟己酸的结合常数略小于全氟丁酸，但是当碳链进一步增长时，结合能力呈增强的趋势，而且结合物数量也增加得更多，在1∶8的物质的量浓度比时，一个肌红蛋白最多可以与7个全氟癸酸分子结合，从结合常数的数量级上看，基本上都处于104级。

3结论

采用电喷雾质谱法研究了4种不同碳链长度的全氟羧酸与肌红蛋白的相互作用。结果表明，全氟丁酸、全氟己酸、全氟辛酸、全氟癸酸均能够与肌红蛋白发生相互作用，且随着物质的量浓度比的增加，复合物峰的数量增多。由结合常数可知，随着碳链的增长，结合能力呈增强的趋势，且结合物数量也增多。在长碳链且高物质的量浓度比时，全氟辛酸、全氟癸酸与肌红蛋白形成了高化学计量比复合物，表明肌红蛋白与全氟羧酸的结合位点有多个。本研究表明，短碳链的全氟羧酸与肌红蛋白结合能力较低，因此，在对全氟化合物功能性质影响不大的情况下采用短链的替代物，有可能减小全氟化合物的环境污染和生物危害。但是，全氟羧酸化合物对肌红蛋白的天然配体血红素的影响仍需要更深入的研究。该实验也进一步验证了电喷雾质谱法是一种研究蛋白质非共价键复合物的有效分析手段。

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Study on Interactions Between Perfluoroalkyl Acids with Different Carbon Chain

Lengths and Myoglobin by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

LI Zhi-xiong,WANG Xian

(CollegeofChemistryandMaterialsScience,South-Central

UniversityforNationalities,Wuhan430074,China)

Abstract：The interactions between heptafluorobutyric acid,undecafluorohexanoic acid,perfluorooctanoic acid,nonadecafluorodecanoic acid with myoglobin were studied by electrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS).The binding constants between four perfluoroalkyl acids and myoglobin were measured by direct calculation method.The effects of carbon chain length of perfluoroalkyl acids on their binding abilities to myoglobin were explored.The results showed that,the binding abilities of interactions between perfluoroalkyl acids with different carbon chain lengths and myoglobin were different,and the binding abilities and numbers of ligand binding to myoglobin increased with the increasing of the carbon chain length.

Keywords：myoglobin;electrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS);heptafluorobutyric acid;undecafluorohexanoic acid;perfluorooctanoic acid;nonadecafluorodecanoic acid;binding ability

中图分类号：TQ 028O 657.63

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2015)05-0029-04

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.05.007

作者简介：李志雄(1989-),男,湖北黄石人,硕士研究生,研究方向：质谱分析研究,E-mail:greyhuli@hotmail.com；通讯作者:王献,教授,E-mail:xwang27@hotmail.com。

收稿日期：2015-02-14

基金项目：国家自然科学基金资助项目(21275167,20705041)，人事部回国留学人员科技活动优先资助项目(BZY14036)