荞麦七提取物的体外抑菌活性研究

王晓梅，郑　涛，马　琳，俎　蕾

(1.宝鸡文理学院化学化工学院，陕西 宝鸡 721013；2.宝鸡市第三人民医院，陕西 宝鸡 721004)

荞麦七提取物的体外抑菌活性研究

王晓梅1，郑涛2，马琳1，俎蕾1

(1.宝鸡文理学院化学化工学院，陕西 宝鸡 721013；2.宝鸡市第三人民医院，陕西 宝鸡 721004)

摘要：以铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌为受试菌，通过最小抑菌浓度测定、抑菌圈的判断、生长曲线的绘制及菌液电导率的测定等方法，研究了荞麦七的4种提取物(水提物、蒽醌、鞣质、黄酮)的体外抑菌活性。结果表明：荞麦七水提物对枯草芽孢杆菌及铜绿假单胞菌抑制作用较强；荞麦七蒽醌对金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌抑制作用较强；荞麦七鞣质对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌抑制作用较强；荞麦七黄酮对大肠杆菌抑制作用最强。

关键词：荞麦七提取物；细菌；抑菌活性

荞麦七，异名白药子、石天荞，为蓼科植物翼蓼PteroxygonumgiraldiiDammer et Diels的块根。荞麦七为多年生木质藤本，属秦岭山区特有的地方性药材，为秦岭“七药”之一。《陕西中草药》及《中药大辞典》记载其性味：酸苦，寒；功效：凉血消瘀，祛湿解毒。主治吐血、衄血、便血、痢疾、崩漏带下、风湿痹痛、疖疮、烧伤等症。因疗效确切而被当地医家广泛使用。作者所在课题组研究发现荞麦七含有蒽醌、鞣质、黄酮及多糖等成分[1-2]。

为开发地方性药材，作者就荞麦七的4种提取物(水提物、蒽醌、鞣质、黄酮)对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌等4种菌的体外抑制作用进行研究，拟为荞麦七治疗感染性疾病提供依据。

1实验

1.1　材料、菌种、培养基、试剂与仪器

荞麦七，购自太白山，经陕西中医学院胡本祥教授鉴定。

铜绿假单胞菌(Pseudomonosaeruginosa)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，陕西省微生物研究所。

LB肉汤培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司；营养琼脂培养基，郑州亚世生物技术有限公司。

荞麦七水提物、荞麦七蒽醌、荞麦七鞣质、荞麦七黄酮均由本实验室制备；其它试剂均为市售分析纯。

SW-CJ-2D型净化工作台，苏州净化设备有限公司；低温生化培养箱，施都凯仪器设备有限公司；SH2-82A型数显恒温旋转式气浴，常州菲普实验仪器厂；AB135-S 型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；DDSJ-308A型电导率仪、752型紫外可见分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司；PowerWave XS2型连续波长酶标仪，美国BioTek公司。

1.2　方法

1.2.1菌悬液的制备

将试验菌接种于营养琼脂平板，37 ℃培养18~24 h，从中选取典型菌落接种于已灭菌的LB肉汤培养基中，37 ℃培养24 h后以无菌生理盐水稀释配制成菌落形成单位(CFU)为107~108个·mL-1的菌悬液，备用。

1.2.2荞麦七提取物最小抑菌浓度(MIC)的测定

取LB肉汤培养基100μL 加入96孔板，分别加入配制好的不同浓度的提取物100μL，混匀，从第一孔中吸取提取物混合液100μL移入第二孔，依次类推。之后于每孔各加入菌悬液100μL。提取物终浓度(mg·mL-1)分别为20、10、5、2.5、1.25、0.628、0.314、0.157，每个样品设3个复孔，重复做3次。37 ℃培养24 h后每孔加入亚甲基蓝10μL，37 ℃继续培养4 h，观察结果，蓝色变浅说明有抑菌作用，蓝色不变为无抑菌作用。以无细菌生长的最高提取物稀释浓度为该提取物对细菌的MIC。

1.2.3抑菌强度的判断

将灭菌后的直径6 mm的中性滤纸片分别浸泡于不同浓度的提取物溶液中，取制备好的菌悬液200μL均匀涂布于营养琼脂平板表面，再将充分浸润过提取物的滤纸片贴放于培养基表面，同时设未浸润提取物的阴性对照片。37 ℃恒温培养24 h，使用游标卡尺测量抑菌圈直径[3]。抑菌圈直径大于7 mm即为有抑菌作用。

1.2.4细菌生长曲线的绘制

取灭菌大试管若干，吸取菌悬液2 mL分别加入盛有20 mL无菌LB肉汤培养基的大试管中，再加入配制好的提取物溶液2 mL(终浓度1.25 mg·mL-1)，对照组不加提取物。试管分别编号为0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h，于37 ℃振荡培养。之后分别按对应时间取出大试管，以无菌悬液的LB肉汤培养基作参比，在600 nm波长处测定吸光度，以时间为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制细菌的生长曲线。

1.2.5细菌溶液电导率的测定

取盛有30 mL已灭菌去离子水的大试管若干，分别加入菌悬液2 mL，加入提取物溶液1 mL(终浓度1.82 mg·mL-1)，对照组不加提取物。大试管分别编号为5 min、10 min、15 min、30 min、60 min、90 min、180 min，于37 ℃振荡培养。然后分别按对应时间取出大试管，迅速使用电导率仪测定电导率[4]。以时间为横坐标、电导率为纵坐标作图。

2结果与讨论

2.1　荞麦七提取物对4种细菌的最小抑菌浓度(表1)

表1　荞麦七提取物对4种细菌的最小抑菌浓度/(mg·mL-1)Tab.1　The MIC of extracts from Pteroxygonum giraldiiagainst 4 kinds of bacteria/(mg·mL-1)

注：“-”表示无抑制作用。

由表1可知，荞麦七的4种提取物对4种菌均有不同程度的抑制作用。荞麦七蒽醌对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌较敏感，MIC均为0.628 mg·mL-1。荞麦七鞣质对大肠杆菌较敏感，MIC为0.628 mg·mL-1，对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌次之，MIC均为1.25 mg·mL-1。荞麦七水提物对铜绿假单胞菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌较敏感，MIC均为1.25 mg·mL-1。荞麦七黄酮对铜绿假单胞菌和大肠杆菌较敏感，MIC分别为1.25 mg·mL-1和0.628 mg·mL-1。

2.2　荞麦七提取物对4种细菌的抑菌圈(表2)

表2　荞麦七提取物对4种细菌的抑菌圈/mmTab.2　Bacteriostatic ring of extracts from Pteroxygonumgiraldii against 4 kinds of bacteria/mm

注：“-”表示抑菌圈<7.0 mm。

由表2可知，荞麦七水提物对铜绿假单胞菌抑制作用较强，最大抑菌圈为14.4 mm；对大肠杆菌的抑菌圈较小，为7.2 mm。荞麦七黄酮对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抑菌圈分别为12.61 mm和10.9 mm。荞麦七鞣质对铜绿假单胞菌的抑菌圈为8.88 mm，对大肠杆菌的抑菌圈为7.33 mm。荞麦七蒽醌对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌均有一定抑制作用，但抑菌圈较小，分别为7.2 mm和7.4 mm。

2.3　荞麦七提取物对细菌生长曲线的影响(图1)

由图1a可知，加有荞麦七鞣质和荞麦七水提物的枯草芽孢杆菌的生长曲线均低于空白组，说明荞麦七鞣质和荞麦七水提物对枯草芽孢杆菌培养8 h后的繁殖均起到了明显的抑制作用；由图1b可知，荞麦七黄酮对大肠杆菌在各个时间段均有抑制作用；由图1c可知，荞麦七鞣质和荞麦七蒽醌均可明显降低金黄色葡萄球菌的生长曲线，说明这2种提取物明显抑制了金黄色葡萄球菌的生长。

2.4　荞麦七水提物对细菌溶液电导率的影响(图2)

由图2a可知，枯草芽孢杆菌溶液的电导率从测试开始至180 min时增加幅度比较小，而菌液中加入荞麦七水提物后的电导率明显高于纯枯草芽孢杆菌组；由图2b可知，荞麦七水提物的加入也明显增大了铜绿假单胞菌溶液的电导率，说明荞麦七水提物具有破坏细菌细胞结构完整性的作用，致使大量低分子量、带电荷的分解物产生而增大了溶液的电导率。

图1荞麦七提取物对枯草芽孢杆菌(a)、大肠杆菌(b)和金黄色葡萄球菌(c)的生长曲线的影响

Fig.1Effect of extracts fromPteroxygonumgiraldiion the growth curves ofBacillussubtilis(a)，

Escherichiacoli(b) andStaphyloccusaureus(c)

图2　荞麦七水提物对枯草芽孢杆菌(a)和铜绿假单胞菌(b)溶液电导率的影响Fig.2　Effect of water extract from Pteroxygonum giraldii on conductivity ofBacillus subtilis(a) and Pseudomonas aeruginosa(b) solution

2.5　讨论

铜绿假单胞菌属革兰氏阴性需氧菌，在自然界分布很广，人体内有条件致病菌寄生，当机体抵抗力低下时可致疾病发生，表现为发热、黄疸、肺炎、泌尿系统感染、脑膜炎等。大肠杆菌属革兰氏阴性菌，人体感染后可导致腹泻、泌尿道感染、新生儿脑膜炎等病。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，可引起急性胃肠炎，表现为恶心、呕吐、腹痛和腹泻等；金黄色葡萄球菌还可引起疖疮、毛囊炎、蜂窝组织炎、伤口化脓及内脏器官感染，甚至引起败血症、脓毒血症等。枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，属于益生菌，在肠道中可建立微生态平衡，促进有益微生物的繁殖，抑制有害细菌的生长，从而预防腹泻、痢疾等肠道疾病。该菌在快速繁殖过程中可产生大量维生素和多种消化酶，能降解植物性饲料中复杂的有机物，从而促进动物消化吸收，提高饲料利用率，防止动物消化不良等状况。

荞麦七在民间使用的历史悠久，治疗范围广泛，但对其化学成分及药理作用的研究报道很少。本实验发现，荞麦七提取物对3种致病菌均有不同程度的抑制作用，与文献记载的治疗范围相符。同时，荞麦七提取物对枯草芽孢杆菌也有抑制作用，而枯草芽孢杆菌属于益生菌，因此荞麦七的使用时间不宜过长，否则可能导致肠道菌群紊乱。荞麦七对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有效，其抑菌的单体成分及具体机理有待进一步研究。

3结论

以铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌为受试菌，通过最小抑菌浓度测定、抑菌圈的判断、生长曲线的绘制及菌液电导率的测定等方法，研究了荞麦七的4种提取物(水提物、蒽醌、鞣质、黄酮)的体外抑菌活性。结果表明：荞麦七水提物对枯草芽孢杆菌及铜绿假单胞菌抑制作用较强；荞麦七蒽醌对金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌抑制作用较强；荞麦七鞣质对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌抑制作用较强；荞麦七黄酮对大肠杆菌抑制作用最强。

参考文献：

[1]刘帆,王晓梅,杨春娟.超声法提取荞麦七中总蒽醌的工艺研究[J].化学工程师,2014,(7):4-6,9.

[2]杨春娟,王晓梅,刘帆.超声辅助法提取荞麦七总黄酮的工艺研究[J].应用化工,2014,43(10):75-77.

[3]徐叔云,卞如濂,陈修.药理学实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,2006:1647.

[4]林向东,张琪,荆仕聪,等.用电导率法测定莲藕冻结点的研究[J].食品科学,2007,28(4):83-86.

Study on Antibacterial Activity of Extracts fromPteroxygonumGiraldiiinvitro

WANG Xiao-mei1,ZHENG Tao2,MA Lin1,ZU Lei1

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,BaojiUniversityofArtsand

Sciences,Baoji721013,China;2.TheThirdPeople′sHospitalofBaoji,Baoji721004,China)

Abstract：Using Pseudomonas aeruginosa，Escherichia coli,Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis as tested bacteria,the antibacterial activity of 4 kinds of extracts from Pteroxygonum giraldiiin vitro were studied by determining the minimal inhibitory concentration,judging bacteriostatic ring,drawing growth curve and determining the electric conductivity.Results show that,water extract from Pteroxygonum giraldii has strong inhibition on Bacillus subtilis and Pseudomonas aeruginosa.Anthraquinone extracted from Pteroxygonum giraldii can inhibit Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa well.Tannin extracted Pteroxygonum giraldii can inhibit strongly on Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Bacillus subtilis.Flavonoids extracted from Pteroxygonum giraldii has the strongest inhibition on Escherichia coli.

Keywords：extracts from Pteroxygonum giraldii;bacteria;antibacterial activity

中图分类号：TQ 461

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2015)05-0040-03

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.05.010

作者简介：王晓梅(1962-)，女，陕西宝鸡人，副教授，研究方向：植物药的基础与应用研究，E-mail：hywangxiaomei@126.com。

收稿日期：2015-01-08

基金项目：陕西省科技发展计划资助项目(2010K01-201)，宝鸡文理学院重点项目(ZK12013)