含水量对不同饲料原料发酵参数的影响

刘晓明 刘法孝 李兆勇 王小明 杨在宾 李祥明

含水量对不同饲料原料发酵参数的影响

刘晓明1刘法孝1李兆勇2王小明1杨在宾1李祥明3

（山东农业大学动物科技学院1，泰安 271018）
（北京科为博生物科技有限公司2，北京 100193）
（山东省饲料质量检验所3，济南 250022）

研究含水量对不同饲料原料发酵品质的影响，采用分组对照试验设计，以乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌分别固态发酵玉米、豆粕和棉籽粕，设30%、40%、50%、60%4个含水量，以感官评价、pH和发酵后益生存留量为发酵品质评定指标。结果表明：随发酵时间延长，pH表现二次曲线的规律（P＜0.01）；含水量显著影响玉米、豆粕和棉籽粕的发酵（P＜0.05），不影响原料初始pH（P＞0.05）；pH达到稳定时，50%含水量的玉米、豆粕和棉籽粕的乳酸菌、枯草芽孢杆菌数量高于其他处理（P＜0.05）。本试验条件下，乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌分别发酵玉米，最佳含水量为50%；乳酸菌、枯草芽孢杆菌分别发酵豆粕和棉籽粕，最佳含水量为60%；酵母菌发酵豆粕和棉籽粕，最佳含水量为50%。

含水量 菌种 pH 感官指标 益生菌存留量

发酵饲料是指在人工控制条件下，微生物通过自身的代谢活动，将植物性、动物性和矿物性物质中的抗营养因子分解或转化，产生更易被动物采食、消化、吸收、利用且无毒害作用的饲料原料［1］。发酵饲料能够改善非常规饲料的品质、提高常规饲料消化率、替代部分或全部抗生素［2］。大量研究发现：发酵饲料中含有的有益微生物和有机酸等，可增强动物机体的免疫力［3］，降低肠道pH、维持肠道健康［4-5］。但是，目前对发酵饲料的研究多集中在饲料营养成分的改变和应用效果方面，关于发酵饲料制作过程中的工艺参数鲜有报道。本试验采用单一菌种发酵不同含水量的原料，以感官评价、原料pH变化和发酵后益生菌存留量作为测定指标，研究饲料品质随发酵时间延长的变化规律，旨在优化制作发酵饲料的工艺参数，为指导实际生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

发酵菌种：乳酸菌（Lactobacillus），3 × 109cfu／g；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），2 ×1010cfu／g；酵母菌，3×108cfu／g，北京科为博生物科技有限公司提供。

发酵原料：玉米（干物质质量分数（DM），86%；粗蛋白质量分数（CP），8.6%），豆粕（DM，89%；CP，44.8%），棉籽粕（DM，89%；CP，47.1%）。采用锤片式粉碎机（2 800转速，40目筛）粉碎。

1.2 试验设计

试验选取3个发酵菌种（乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌）、3种发酵原料（玉米、豆粕、棉籽粕）。每个菌种和原料设4个含水量，分别为30%、40%、50%和60%。

1.3 试验方法

发酵菌种按一定比例与灭菌（紫外线照射法）原料混合，加蒸馏水调节至相应处理水分含量，搅拌均匀，装入塑料桶（15 kg），密封发酵，发酵温度控制在35～37°C。每个处理6个重复，每12 h测量pH（每个做3个平行），连续测量12次。用12次测量pH拟合二次曲线。当各重复发酵原料pH稳定不变时，取样，测定感官指标，检测益生菌含量。

1.4 样品检测

pH：根据参考文献［6］，称取10 g发酵样品，放入三角瓶中，加入90 mL蒸馏水。用磁力搅拌器搅拌30 min，静置10 min后用pH计测定。重复3次取平均值。

物理性状：参照GB 10220—2012［7］和GB 21172—2007［8］感官分析方法，设定在光线正常及无异味的环境下，将适量样品倒入洁净的白色瓷盘内或干净的玻璃容器中，通过目测、鼻嗅、口尝分别评定样品的颜色、气味等。

乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌总数：按GB 4789.35—2010［9］、GB／T 26428—2010［10］、GB 4789.15—2010［11］测定。

1.5 数据处理

数据处理采用SAS 9.1的ANOVA进行方差分析，并用Duncan′s法进行多重比较，P＜0.05为差异显著，采用Origin 9.1进行二次线性拟合（f（x）＝a x2＋b x＋c），a为二次项系数，b为一次项系数，c为常数项。

2 结果与分析

2.1 原料pH变化

不同含水量的原料达到稳定pH所需时间如图1所示，发酵后不同含水量的玉米、豆粕和棉籽粕pH达到稳定所需时间不同。乳酸菌作为发酵菌种，含水量为50%的玉米、含水量为60%的豆粕和棉籽粕，pH首先达到稳定；酵母菌发酵不同原料，含水量为40%的玉米、含水量为50%的豆粕和棉籽粕，pH首先达到稳定；枯草芽孢杆菌发酵后，50%含水量的玉米和豆粕，60%含水量的棉籽粕pH最先达到稳定状态。由以上结果分析可知，相同含水量的原料，达到pH稳定所需的时间玉米＜棉籽粕＜豆粕。

不同含水量的玉米、豆粕和棉籽粕经乳酸菌发酵后，原料的pH变化规律见表1。由表1可知，不同含水量的原料pH随发酵时间的延长逐渐降低并表现出二次曲线的规律（P＜0.01）。40%、50%、60%含水量的玉米pH的拟合方程系数a和系数b显著高于30%含水量的玉米（P＜0.05），但各处理差异不显著（P＞0.05）。乳酸菌发酵豆粕，原料pH拟合方程a值与含水量呈正相关且差异显著（P＜0.05），拟合方程b值与含水量呈负相关，30%和40%含水量的豆粕pH拟合方程b差异显著（P＜0.05），其余各处理差异不显著（P＞0.05）。乳酸菌发酵棉籽粕，除40%与50%含水量棉籽粕pH拟合方程a差异不显著，其余各处理两两差异显著（P＜0.05），拟合方程b值随含水量升高逐渐降低并差异显著（P＜0.05）。含水量对乳酸菌发酵玉米、豆粕和棉籽粕拟合方程c值无显著影响（P＞0.05）。以上结果分析表明，不同原料a值最大的含水量处理不同；含水量显著影响3种原料的pH变化，对发酵初始pH（c值）无显著影响。

图1 不同原料发酵达到稳定pH的时间

表1 乳酸菌发酵不同含水量的原料的pH变化规律

由表2分析可知，以酵母菌为发酵菌种，原料的pH随时间的延长逐渐降低并表现出二次曲线的规律（P＜0.01）。酵母菌发酵玉米，50%含水量的玉米pH拟合方程a值最大，与30%和40%含水量玉米差异显著（P＜0.05），与60%含水量玉米差异不显著（P＞0.05）；拟合方程b值逐渐降低，40%与50%含水量处理差异显著（P＜0.05）。酵母菌发酵豆粕，50%含水量豆粕pH拟合方程a值最大，并与其他处理差异显著（P＜0.05），拟合方程b值与含水量呈负相关，50%与60%含水量豆粕差异显著（P＜0.05）。酵母菌发酵棉籽粕，50%含水量棉籽粕pH拟合方程a值显著高于其他处理，b值显著低于其它处理（P＜0.05）。含水量对酵母菌发酵玉米、豆粕和棉籽粕拟合方程c值无显著影响（P＞0.05）。综上所述，3种原料经酵母菌发酵后，拟合方程a值均是50%含水量处理最大，发酵初始pH（c值）无显著差异。

表2 酵母菌发酵不同含水量的原料的pH变化规律

从表3可以看出，枯草芽孢杆菌分别发酵不同含水量的玉米、豆粕和棉籽粕，原料的pH变化随时间的增长逐渐降低并表现出二次曲线的规律（P＜0.01）。含水量对枯草芽孢杆菌发酵玉米pH拟合方程系数a值、b值无显著影响（P＞0.05）。枯草芽孢杆菌发酵豆粕，拟合方程a值与含水量呈正相关，b值与含水量呈负相关，50%和60%含水量的豆粕a值、b值差异不显著（P＞0.05），其他处理两两差异显著（P＜0.05）。枯草芽孢杆菌发酵棉籽粕，拟合方程a值与含水量正相关，并差异显著（P＜0.05）；30%与40%含水量棉籽粕拟合方程b值差异显著（P＜0.05）。含水量对枯草芽孢杆菌发酵玉米、豆粕和棉籽粕拟合方程c值无显著影响（P＞0.05）。由以上分析可知，含水量对枯草芽孢杆菌发酵玉米pH变化无影响，60%含水量的豆粕和棉籽粕拟合方程a值最大，发酵初始pH（c值）无显著差异。

表3 枯草芽孢杆菌发酵不同含水量的原料的pH变化规律

2.2 感官评价

不同含水量的原料发酵后的感官品质测定结果见表4。感官性状分析表明：玉米经乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌分别发酵后，呈现黄色、酸香味，有粘连，并且随着含水量增加，颜色、酸味、黏度逐渐增强，50%含水量时达到最大值，含水量为60%时上述指标反而有所降低；对豆粕发酵的结果表明，3个菌种发酵后，表现为土黄色、酸香味，有粘连，随着含水量的增加，颜色逐渐变浅，气味和黏度逐渐增强；3个菌种分别发酵棉籽粕后，表现为酸味和弱醇香、褐色、强粘连，随着含水率的升高，上述指标均增强。以上结果表明，3种原料发酵后颜色和气味各呈现相应的特性，而黏度强度依次为：棉籽粕＞豆粕＞玉米。

表4 不同含水量的原料发酵后感官评价结果

2.3 菌种计数

乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌发酵不同含水量原料的益生菌计数结果见表5。由表5可以看出，含水量显著影响不同原料的益生菌的存留量（P＜0.05）。乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌发酵玉米，50%含水量处理益生菌计数显著高于其他处理（P＜0.05）；经乳酸菌和酵母菌分别发酵后，50%含水量的豆粕和棉籽粕益生菌存留量显著高于其他处理（P＜0.05）；枯草芽孢杆菌发酵豆粕，40%含水量处理益生菌存留量显著高于其他处理（P＜0.05），枯草芽孢杆菌发酵棉籽粕，40%含水量的处理益生菌存留量显著高于其他处理（P＜0.05）。以上结果分析表明，含水量显著影响原料发酵后益生菌数，在pH达到稳定时，益生菌存留数量：棉籽粕＞豆粕＞玉米。

表5 不同菌种发酵不同含水量的原料益生菌计数结果

3 讨论

3.1 含水量对不同原料发酵pH变化的影响

在本试验中，pH是微生物增殖最直观的反映指标，通过数学手段分析，降低相同的pH，拟合方程二次项系数a值越大，发酵进程越快。所以，a值的大小直接能反映出发酵的快慢。以乳酸菌为发酵菌种，50%含水量的玉米、豆粕和60%含水量的棉籽粕发酵最快；以酵母菌为发酵菌种，50%含水量的玉米、豆粕和棉籽粕发酵最快；以枯草芽孢杆菌为发酵菌种，50%含水量的玉米a值最大，但差异不显著，60%含水量的豆粕和棉籽粕a值最大并差异显著。Malathi等［12］利用黄曲霉固态发酵生产碱性蛋白酶，对含水量的优化结果显示，在35%～80%的含水量间，当含水量为63%时，碱性蛋白酶活性迅速增加并且活性最大；Naveena等［13］研究固态发酵嗜淀粉乳杆菌生产乳酸，在发酵条件优化过程中发现，35%～85%的含水量范围内，当用麸皮作为底物时，含水量为83%的乳酸得率最高，而选用不同的豆类为底物时，含水量分别在75%～80%的水平下乳酸得率较高，这与本研究结果相一致。同时，杨玉芬等［14］优化复合益生菌发酵豆粕的初水分研究发现30%水分为豆粕的最佳发酵水分，与本试验结果有差异，这可能是因为水分设置梯度不同。常数项c值大小反映了发酵初始pH，初始pH主要与基质本身性质和含水量相关。总体来说，30%含水量的处理a值都比较小，这是因为含水量过少，物料膨胀程度和营养物质溶解性低，造成微生物发酵周期较长，pH降低缓慢［15］。

3.2 含水量对不同原料发酵后感官品质的影响

发酵后颜色与原料本身高度相关且和菌种类无关，这表明发酵过程没有破坏原料本身的色素和生成新的色素；随着发酵水分的升高，玉米颜色逐渐加深，50%处理达到最大值，豆粕颜色逐渐降低，棉籽粕颜色逐渐加深，这是因为玉米60%处理已经介于固体和液体发酵之间，所以颜色变浅；豆粕和棉籽粕由于本身的物理特性，表现出颜色随发酵水分的升高而变浅或加深。原料发酵气味和微生物的代谢密切相关，乳酸菌发酵玉米（50%处理）、豆粕和棉子粕（60%处理）均表现出强酸香味，酵母菌和枯草芽孢杆菌发酵玉米（50%处理）、豆粕和棉子粕（60%处理）均表现出酸味、弱醇味。乳酸菌主导的发酵表现酸味是因为产生大量产生乳酸等有机酸所致［16］；而酵母菌和枯草芽孢杆菌主导发酵表现的醇味则是由于细菌或真菌的代谢活动在固态条件下传质、传热障碍产生了醇类物质所致［17］。

3.3 含水量对基质菌种存留量的影响

菌落计数是衡量微生物发酵水平的重要指标［18］，能直接反映发酵原料和菌种的优劣性。固态发酵最大的特点是没有或几乎没有游离水存在，水分含量影响到原料的物理状态、营养物质的扩散及利用、氧和二氧化碳的交换及传热、传质过程，原料含水量的变化，必然会对微生物的生长与代谢能力产生重要的影响。含水量过高，导致基质颗粒间孔隙率的降低、粘性增加，增加了氧的传质阻力；而含水量过低，导致固态介质中营养成分溶解度的下降及较低的基质膨润度，微生物生长受抑制［19］。因此本研究中，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌发酵不同原料，益生菌存留量最高都为含水量40%或50%处理。综合分析3种原料，发现益生菌存留量：棉籽粕＞豆粕＞玉米，这可能是由于蛋白质含量影响益生菌的生长。陶治平［20］研究发现，蛋白质浓度对发酵体系中的酶活性有显著影响，脱氢酶和中性蛋白酶活性都随蛋白质浓度的增加而提高，中性蛋白酶活性上升特别明显。微生物发酵体系中酶活性升高，有利于微生物的增殖，关于蛋白质影响发酵的具体内容有待于进一步研究探讨。

4 结论

在本试验条件下，含水量显著影响发酵进程，不同的原料达到稳定pH所需时间不同，相同含水量的原料，达到pH稳定所需的时间：玉米＜棉籽粕＜豆粕；选择合适含水量，可以缩减发酵时间，获得良好的饲料品质。综合考察各指标，乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌分别发酵玉米，适合的含水量为50%；乳酸菌、枯草芽孢杆菌分别发酵豆粕和棉籽粕，适合的含水量为60%；酵母菌发酵豆粕和棉籽粕，适合的含水量为50%。

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Effects of Water Content on Fermentation Parameters of Different Fodder Substrates

Liu Xiaoming1Liu Faxiao1Li Zhaoyong2Wang Xiaoming1Yang Zaibin1Li Xiangming3
（College of Animal Science and Technology，Shandong Agricultural University1，Taian 271018）
（CRVAB Bio-tech Group2，Beijing 100193）
（Shandong Feed Quality Ispection Institute3，Jinan 250022）

In this study，the effects of moisture content on fermentation quality were investigated.This study adopted the grouping control experimental design，using solid-fermentation on corn，soybean meal，and cottonseed meal through different strains（Lactobacillus，yeast and bacillussubtilis），under four moisture contents，30%，40%，50%and 60%and with sensory evaluation，pH and amount of probiotics retention as the indicators of fermentation quality assessment.Results indicated that with the extension of fermentation time，the pH showd the law of quadratic curve（P ＜0.01），Water content had a significant influence on the fermentation process of corn，soybean meal and cottonseed meal（P ＜0.05），but has no effect on the initial pH of raw materials（P ＞0.05）.When pH remains stable，the number of lactobacillus and bacillus subtilis for corn，soybean meal and cottonseed meal with 50%moisture content was significantly higher than other treatment（P ＜0.05）.The optimum suitable amount of water was 50%when lactobacillus，yeast or bacillus subtilis were used to fermente corn；And the most suitable amount of water was 60%when soybean meal or cottonseed meal was fermented by lactobacillus or bacillus subtilis；If the soybean meal and cottonseed meal were fermented with yeast，the most suitable amount of water was 50%.

water content，strain，pH，sensory parameters，residual probiotic

S816.6

A

1003-0174（2016）09-0100-06

山东省现代农业产业技术体系生猪创新团队建设（SDAIT-06-022-04）

2014-11-29

刘晓明，男，1988年出生，硕士，动物营养与饲料科学

杨在宾，男，1961年出生，教授，博士生导师，动物营养与饲料科学