甲酯化方法对甘油三酯和游离型脂肪酸混合物脂肪酸分析的影响

张白曦 宋宇航 杨 芹 张 灏 陈 卫，2

甲酯化方法对甘油三酯和游离型脂肪酸混合物脂肪酸分析的影响

张白曦1宋宇航1杨 芹1张 灏1陈 卫1，2

（江南大学食品学院1，无锡 214122）
（江南大学食品科学与技术国家重点实验室2，无锡 214122）

在重组解脂耶氏酵母催化红花籽油合成共轭亚油酸的过程中，大量的红花籽油与游离型亚油酸及共轭亚油酸以混合物的形式存在于发酵液上清。为了通过气相色谱准确分析催化过程中底物及产物的含量，确定甘油三酯和游离型脂肪酸混合物的最佳甲酯化方法至关重要。本试验选择盐酸-甲醇法、盐酸-甲醇（甲苯）法、三氟化硼-甲醇法、氢氧化钠-甲醇法、酸碱综合法和重氮甲烷法6种方法，对红花籽油、游离型共轭亚油酸和二者混合物分别进行甲酯化，通过气相色谱定量分析，比较甲酯化效率。结果表明盐酸-甲醇（甲苯）法甲酯化程度高，且操作简便、安全、经济，是样品为甘油三酯和游离型脂肪酸混合物的最适甲酯化方法。

甘油三酯 游离型脂肪酸 共轭亚油酸 甲酯化效率

气相色谱法是一种快速、高选择性、高分离效能的分析方法，广泛应用于甘油三酯、脂肪酸及其衍生物的定性、定量分析［1］。由于构成脂类物质的脂肪酸，特别是十二碳以上的长链脂肪酸沸点高、高温下易裂解，需先对脂类物质进行甲酯化，与甲醇反应制备成脂肪酸甲酯，降低沸点，提高稳定性，然后进行气相色谱分析［2］。目前常用的甲酯化方法主要有酸催化法、碱催化法及重氮甲烷法。酸催化法常用试剂为盐酸-甲醇、硫酸-甲醇和三氟化硼-甲醇；碱催化法常用试剂为甲醇钠和氢氧化钾-甲醇；重氮甲烷法使用试剂为三甲基硅重氮甲烷［3-5］。不同甲酯化方法适用的脂类物质范围也不尽相同，甲酯化方法选择不当会直接影响脂肪酸测定结果的准确性。因此，依据试验样品特性及试验目的，选择合适的甲酯化方法至关重要。必要时，还需对甲酯化方法进行改进，比如选择甲酯化试剂的类型、酸碱浓度、反应时间和温度等［6］。

本实验室在重组解脂耶氏酵母生物催化过程中，以含大量亚油酸甘油酯的红花籽油为底物，合成产物t10，c12-共轭亚油酸（t10，c12-CLA）。在发酵培养过程中，解脂耶氏酵母分泌大量脂肪酶以水解红花籽油（甘油三酯），生成以亚油酸（LA）为主的多种游离型脂肪酸，游离型亚油酸在共轭亚油酸异构酶催化下合成游离型共轭亚油酸，使发酵液转换为甘油三酯和游离型脂肪酸混合的复杂样品体系［7］。为了通过气相色谱准确测定甘油三酯和游离型脂肪酸组成的混合样品中的脂肪酸含量，本试验研究了盐酸-甲醇法、盐酸-甲醇（甲苯）法、三氟化硼-甲醇法、氢氧化钠-甲醇法、酸碱综合法和重氮甲烷法对由甘油三酯和游离脂肪酸组成的脂质混合物的甲酯化效率及对共轭亚油酸单体的异构化程度，确定了一种适用于解脂耶氏酵母生物转化共轭亚油酸体系中脂质分析的甲酯化方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红花籽油：邯郸晨光珍品甘油三酯有限公司；亚油酸甲酯标准品、t10，c12-共轭亚油酸标准品、十七烷酸甲酯标准品、脂肪酸甲酯37混标、共轭亚油酸甲酯混合物标准品：sigma公司（约42%c9，t11-CLA 和t9，c11-CLA、约44%t10，c12-CLA、约10%c10，c12-CLA）；盐酸甲醇溶液：如东宝湾利昌化工有限公司；重氮甲烷（三甲基硅烷基）：上海百灵威化学技术有限公司；三氟化硼：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

GC-2010气相色谱仪：岛津公司（配FID检测器）。

1.3 试验方法

1.3.1 盐酸-甲醇法［7］

称取约10 mg红花籽油或亚油酸于5 mL玻璃瓶，加入10%盐酸-甲醇溶液1 mL，50℃水浴2 h，每0.5 h振荡30 s；再加入饱和氯化钠1 mL。

加入正己烷1 mL萃取脂肪酸甲酯，剧烈振荡30 s，3 000 r／min 离心3 min，吸取上层正己烷有机相，重复以上步骤1次，2次正己烷萃取液混合；通N2吹干，再加入1 mL正己烷溶解，转移至1.5 mL气相瓶，进行气相色谱分析。

1.3.2 盐酸-甲醇（甲苯）法［8］

称取约10 mg红花籽油或亚油酸于5 mL玻璃瓶，加入10%盐酸-甲醇溶液1 mL，甲苯0.5 mL；50℃水浴2 h，每0.5 h振荡30 s；再加入饱和氯化钠1 mL。

加入正己烷1 ml萃取脂肪酸甲酯，剧烈振荡30 s，3 000 r／min 离心3 min，吸取上层正己烷有机相，重复以上步骤1次，2次正己烷萃取液混合；通N2吹干，再加入1 mL正己烷溶解，转移至1.5 mL气相瓶，进行气相色谱分析。

1.3.3 三氟化硼-甲醇法［8］

称取约10 mg红花籽油或亚油酸于15 mL玻璃瓶，加入0.5 mol／L氢氧化钠-甲醇溶液2 mL，60℃水浴30 min，间隙性晃动；再加入现配三氟化硼2 mL，70 ℃水浴3～5 min。

加入2 mL正己烷，振荡3～4 min。加入1 mL饱和氯化钠，吸取上层正己烷有机相1.5 mL置离心管中，加入无水硫酸钠吸水，10 000 r／min离心5 min，再转移至1.5 mL气相瓶，进行气相色谱分析。

1.3.4 氢氧化钠-甲醇法［8］

称取约10 mg红花籽油或亚油酸于5 mL玻璃瓶，加入0.5 mol／L氢氧化钠-甲醇溶液1 mL，振荡2 min，室温反应20 min；再加入饱和氯化钠1 mL。

加入正己烷1 mL萃取脂肪酸甲酯，剧烈振荡30 s，3 000 r／min 离心3 min，吸取上层正己烷有机相，重复以上步骤1次，2次正己烷萃取液混合；通N2吹干，再加入1 mL正己烷溶解，转移至1.5 mL气相瓶，进行气相色谱分析。

1.3.5 酸碱综合法［8］

称取约10 mg红花籽油或亚油酸于5 mL玻璃瓶，加入0.5 mol／L氢氧化钠-甲醇溶液1 mL，70℃水浴20 min；再加入10%盐酸-甲醇溶液1 mL，70℃水浴30 min；最后加入饱和氯化钠1 mL。

加入正己烷1 mL萃取脂肪酸甲酯，剧烈振荡30 s，3 000 r／min 离心3 min，吸取上层正己烷有机相，重复以上步骤1次，2次正己烷萃取液混合；通N2吹干，再加入1 mL正己烷溶解，转移至1.5 mL气相瓶，进行气相色谱分析。

1.3.6 重氮甲烷法［9］

称取约10 mg红花籽油或亚油酸于5 mL玻璃瓶，加入20μL三甲基硅烷重氮甲烷和400μL甲醇溶液，室温反应15 min；加入5%乙酸溶液5μL，通N2吹干，通N2吹干，再加入1 mL正己烷溶解，转移至1.5 mL气相瓶，进行气相色谱分析。

1.3.7 气相色谱分析条件

色谱柱为DB-WAX（30 m ×0.32 mm，φ0.25 μm；Agilent，美国），氢火焰离子（FID）检测器检测；氮气为载气，流量为2 mL／min，采用分流方式进样1μL，分流比为15∶1，进样口温度为240℃；升温程序如下：120℃保持3 min，以5℃／min升温速度至190℃，再以1℃／min升温速度至温度达到210℃，保持3 min。

脂肪酸甲酯标准品气相色谱分析，并通过保留时间对样品脂肪酸定性；十七烷酸甲酯为内标物，通过面积归一法计算红花籽油和共轭亚油酸的含量，进行定量分析。

1.3.8 脂肪酸回收率

通过不同的甲酯化方法对样品进行甲酯化及气相色谱分析，根据峰面积归一化法定量计算出测定的总脂肪酸质量（TFA），TFA与加入样品的脂肪酸总量之比即TFA回收率，据此判定甲酯化的效率，TFA回收率越高，表明甲酯化效率越高。

2 结果与分析

2.1 不同甲酯化方法对红花籽油定量分析的影响

红花籽油中脂肪酸组成如图1所示，其中亚油酸是其最主要脂肪酸，其次为油酸。对于甘油三酯类红花籽油的甲酯化结果如图2，盐酸-甲醇（甲苯）法、三氟化硼-甲醇法、氢氧化钠-甲醇法和酸碱综合法得到的TFA回收率接近100%，甲酯化效率高；而盐酸-甲醇法的TFA回收率偏低；重氮甲烷法的TFA回收率仅为1%，说明盐酸-甲醇（甲苯）法、三氟化硼-甲醇法和酸碱综合法适用于甘油三酯类脂肪酸的甲酯化。

图1 红花籽油中各种脂肪酸占总脂肪酸的比例

虽然盐酸-甲醇法和盐酸-甲醇（甲苯）法都是基于盐酸催化甲酯化的原理，但其对于红花籽油的催化效率相差较大，盐酸-甲醇法处理后的TFA回收率比盐酸-甲醇（甲苯）法低近30%。这是因为非极性的甘油三酯难溶于含有甲醇的有机溶剂，影响了甲酯化反应效率，而苯（高毒，不推荐使用）、甲苯和四氢呋喃的加入可以提高脂类物质溶解性，进而提高了甲酯化效率［10］。

2.2 不同甲酯化方法对游离型共轭亚油酸定量分析的影响

从图3可以看出：对于游离型共轭亚油酸的甲酯化，盐酸-甲醇法、盐酸-甲醇（甲苯）法、三氟化硼-甲醇法、酸碱综合法及重氮甲烷法得到的TFA回收率均接近100%，甲酯化效率高。而氢氧化钠-甲醇法得到的TFA回收率只有5%左右，这是由于游离型脂肪酸遇碱形成稳定的羧酸离子，使甲酯化反应不完全且反应速率降低，因此碱催化法不适用于游离型共轭亚油酸的甲酯化。

图3 游离型CLA经不同甲酯化方法处理后的TFA回收率

由图4可知，盐酸-甲醇法、盐酸-甲醇（甲苯）法、三氟化硼-甲醇法、酸碱综合法均导致了样品反10，顺12-共轭亚油酸（t10，c12-CLA）发生一定程度的异构化，产生同分异构体反10，反12-共轭亚油酸（c10，c12-CLA）。这与Park［13］研究结论一致，因为酸催化甲酯化法需要的反应温度较高（一般在50℃以上）且反应时间较长，容易导致CLA同分异构体的出现。而重氮甲烷催化的甲酯化反应产物单一，无其他异构体生成，这是由于重氮甲烷法的反应条件温和（室温）且反应迅速，尤其适合含有共轭双键的脂肪酸甲酯化，大大降低共轭脂肪酸的异构化［5，13］。

图4 不同甲酯化方法衍生化后的t10，c12-CLA气相色谱图

2.3 不同甲酯化方法对红花籽油和游离型共轭亚油酸混合物定量分析的影响

对于红花籽油和游离型共轭亚油酸混合物甲酯化效率的结果（图5）与之前对2种成分分别甲酯化的结果（图2和图3）一致，氢氧化钠-甲醇法和重氮甲烷法的TFA回收率最低，在50%左右，这是由于氢氧化钠-甲醇法对游离脂肪酸的甲酯化效率低，而重氮甲烷法对甘油三酯的甲酯化效率低，所以不适合混合样品的甲酯化；盐酸-甲醇法得到的TFA回收率在85%左右，该方法对甘油三酯甲酯化效率较低；而盐酸-甲醇（甲苯）法、三氟化硼-甲醇法和酸碱综合法TFA回收率接近100%，说明这3种方法均适合于目前甘油三酯和游离脂肪酸混合物样品的甲酯化。但由于酸碱综合法的操作步骤多；而三氟化硼-甲醇法使用的三氟化硼-甲醇溶液保藏时间短，使用浓度过高会生成脂肪酸衍生物［11］，且三氟化硼遇湿气立即水解生成剧毒的氟化物烟雾，当样品中存在缩醛磷脂时，醛类能和该试剂反应生成二甲缩醛，该物质基本不可能从大部分脂肪酸甲酯中分离出来［12］。综合考虑，盐酸-甲醇（甲苯）法是催化甘油三酯和游离脂肪酸混合物样品的首选方案。

尽管目前的盐酸-甲醇（甲苯）法能够准确高效地检测CLA的总量，但是考虑到共轭亚油酸在甲酯化过程中易发生异构化的情况（图4），为了提高对于CLA单体的定量准确性，在接下来的研究中，需要对盐酸-甲醇（甲苯）法的催化条件，包括反应温度、反应时间、催化剂浓度进行进一步优化，尽可能降低共轭亚油酸异构化程度。

图5 红花籽油和游离型CLA混合物经不同甲酯化方法处理后的TFA回收率

3 结论

通过比较6种不同的甲酯化方法对甘油三酯类物质红花籽油、游离型脂肪酸t10，c12-共轭亚油酸、以及二者混合样品的甲酯化效率，发现盐酸-甲醇（甲苯）法、三氟化硼-甲醇法和酸碱综合法的甲酯化效率高，样品的回收率均接近100%。综合考虑操作的简便性、试剂的安全性和经济性，盐酸-甲醇（甲苯）法为分析解脂耶氏酵母生物催化法合成共轭亚油酸体系的首选甲酯化方法。为进一步提高对于CLA单体的检测准确性，需在今后研究中对盐酸-甲醇（甲苯）法的甲酯化反应条件进行优化。

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Comparison of Methyl Esterification Methods in Fatty Acids Determination of the Mixture Composed of Triglycerides and Free Fatty Acids

Zhang Baixi1Song Yuhang1Yang Qin1Zhang Hao1Chen Wei1，2
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University1，Wuxi 214122）
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University2，Wuxi 214122）

During the conjugated linoleic acid（CLA）synthesised by recombinant Yarrowia lipolytica，catalytic safflower seed oil，plentiful safflower seed oil，free-floating type linoleic acid （LA）and conjugated linoleic acid were existed in the form of mixture in fermented supernatant.In order to analyze the content of substrate and outcome in the catalytic process by gas chromatography accurately，it was crucial to determine the best methyl esterification methodof mixtures of triglycerides and free fatty acids.In this study，six different methods including hydrochloric acid-methanol method，hydrochloric acid-methanol（add methylbenzene）method，BF3-methanol method，NaOH-methanol method，acid-base synthetic method，diazomethane method were selected to carry out methyl esterification for the safflower seed oil and free-floating type conjugated linoleic acid and their mixtures respectively，by chromatogram ration analysis and then compare efficiency of methyl esterification.The results obtained showed that hydrochloric-methanol（add methylbenzene）method was the optimal methyl esterification method for the mixture sample composed of triglycerides and free fatty acids，due to the high methyl esterification efficiency，user-friendly control and low toxicity and cost.

triglycerides，free fatty acids，conjugated linoleic acid，methyl esterification efficiency

TQ646

A

1003-0174（2016）09-0095-05

时间：2016-08-10 17：20：50

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／11.2864.TS.20160810.1720.006.html

江苏省自然科学基金（BK20150144）

2015-10-29

张白曦，女，1983年出生，讲师，食品微生物技术

陈卫，男，1966年出生，教授，食品生物技术