AQP4、AQP9 在便秘小鼠结肠黏膜中的表达

王晓玲，李亚妮，江 梅，李信民

1.西安市第四医院消化内科，陕西 西安710004;2.延安妇幼保健院内科;3.西安交通大学医学院分子生物学教研室

便秘是由不同病理过程引起的一种复杂临床症状，主要是指排便次数减少、粪便干结、排便费力等，严重影响患者生活质量;肠道水代谢紊乱是便秘的主要发病机制，特别是结肠内水转运异常与其有直接关系。水通道蛋白(AQPs)是一个具有跨膜运输水分子功能的蛋白家族，目前发现哺乳动物消化道有9 种AQPs亚型表达，其中AQP1、3、4、8、9 在结肠有表达，与结肠内水分的吸收和分泌关系密切，已有研究表明AQP4与水分吸收密切相关，而AQP9 则主要参与水分分泌［1-3］。本实验通过构建小鼠便秘模型，利用RT-PCR技术对便秘小鼠结肠黏膜AQP4 mRNA、AQP9 mRNA表达情况进行研究，探讨其与便秘的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 体质量(20 ±2.0)g 的雄性昆明小鼠20 只，由西安交通大学实验动物中心提供。小鼠随机分为对照组和便秘组，每组10 只。

1.2 实验药品及试剂 复方地芬诺酯片(常州康普药业有限公司);阿拉伯树胶(沧州市康鑫蜂蜡胶业有限公司);活性炭(西安鑫宝佳业化工有限公司)。墨汁的配置［4］:称取阿拉伯树胶50 g，加水400 ml，煮沸至溶液透明，称取活性炭25 g 加至上述溶液中煮沸3次，待溶液凉后加水定容至500 ml 备用。RT-PCR 试剂盒(MBI Fermentas 公司);RNA 提取液Trizol(美国Invitrogen 公司);琼脂糖(北京奇松生物科技有限公司)DNA marker(上海生物工程技术服务有限公司)。1.3 方法

1.3.1 便秘模型构建:参照文献［5］，实验小鼠均单只单笼饲养，实验前12 h 禁食不禁水，便秘组给予50 mg/kg·BW 的复方地芬诺酯灌胃，阴性对照组给予等量的蒸馏水灌胃。灌胃后小鼠均正常饮食进水，比较对照组与便秘组小鼠首粒排便时间、12 h 内排便粒数和12 h 内排便重量，差异有统计学意义，便秘模型制备成功。

1.3.2 取材:实验小鼠以水合氯醛腹腔麻醉并处死，迅速取升、降结肠组织各1 块放入EP 管中，置于-85℃冰箱，供反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)使用。

1.3.3 RT-PCR 测定结肠AQP4 mRNA、AQP9 mRNA表达:首先按照Trizol 试剂盒说明书提取标本中的总RNA，然后按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录。在NCBI 基因库中分别查出AQP4、AQP9 的基因序列，之后应用Primer 软件来设计各自的引物序列并由上海生物工程技术服务有限公司合成。选用β-actin 基因为内参照引物基因，反应中所用的上游引物为:5＇-CTA CAA TGA GCT GCG＇TGT GCC-3＇，下游引物为5＇-CAG GTC CAG ACG ACG CAG GAT GGC-3＇，扩增产物为:270 bp;AQP4 上游引物为:5＇-GGG TTG GAC CAA TCA TAG GCG CT-3＇，下游引物为:5＇-GCA GGA AAT CTG AGG CCA GTT CTA GG-3＇，扩增产物为:330 bp;AQP9 上 游 引 物 为:5＇-GATGCCTTCTGAGAAGGACA-3＇，下游引物为:5＇-CGATGCTCTTGGTATTGGCT-3＇，扩增产物为:218 bp。

1.3.4 琼脂糖凝胶电泳及半定量分析:取PCR 扩增产物5 μl，置1%琼脂糖凝胶中，TBE 电泳缓冲液中4 V/cm 电压电泳60 min，用GDS7500 图像分析系统(英国UVP 公司)进行密度扫描定量，以AQP4、AQP9 基因与β-actin 比值表示AQP4 mRNA、AQP9 mRNA 的相对表达量。

1.4 统计学处理 所有数据均采用SPSS 17.0 软件分析，计量资料以s 表示，数据经正态检验呈正态分布，采用两个独立样本t 检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

10 只便秘小鼠均造模成功，无小鼠死亡。对照组及便秘组小鼠升、降结肠均有AQP4 mRNA、AQP9 mRNA 表达;便秘组升结肠中AQP4 mRNA 表达量高于对照组(P ＜0.05)，升结肠中AQP9 mRNA 两组比较差异无统计学意义(P ＞0.05);便秘组降结肠中AQP9 mRNA 低于对照组(P ＜0.05)，AQP4 mRNA 高于对照组(P ＜0.05，见表1)。

表1 便秘组和对照组升、降结肠AQP4 mRNA、AQP9 mRNA 的表达量Tab 1 Expression of AQP4 mRNA and AQP9 mRNA in ascending and descending colon of constipation group and normal group

3 讨论

便秘是临床常见的复杂症状，按照病因可分为器质性便秘和功能性便秘。器质性便秘解除病因后便秘症状即可缓解;功能性便秘则根据病理生理学机制又可分为慢传输型便秘、出口梗阻型便秘和混合型便秘，其中慢传输型便秘在临床上非常常见，主要指肠道动力降低、肠内容物从近端结肠向远端结肠运动的速度低于正常人，引起肠道水代谢异常，粪便中水分的重吸收增加或分泌减少，导致大便含水量减少，大便干结，排便费力。

AQPs 是与水代谢密切相关的蛋白家族，主要分布在与体液吸收和分泌密切相关的上皮细胞和内皮细胞，具有重要的病理生理意义［6-7］。AQP4、AQP9 在结肠均有表达，且其表达细胞有差异，AQP4 主要表达于吸收上皮细胞，而AQP9 主要表达于杯状细胞，分别参与肠道的吸收和分泌功能［8-9］。

本实验通过复方地芬诺酯灌胃构建功能性便秘小鼠模型，研究其升、降结肠AQP4 mRNA、AQP9 mRNA表达，结果发现对照组及便秘组小鼠升、降结肠均有AQP4 mRNA、AQP9 mRNA 表达;两组升结肠AQP4 mRNA 表达量均高于降结肠(P ＜0.01);便秘组升、降结肠AQP4 mRNA 表达量均较正常对照组升高(P ＜0.05)，提示便秘时AQP4 mRNA 表达增加，导致肠道粪便中的水分重吸收增加，粪便中含水量减少，大便干结;便秘组升结肠AQP4 mRNA 升高更为显著(P ＜0.01)，这与升结肠为结肠水分吸收的主要部位有关。同时我们研究发现便秘组升、降结肠AQP9 mRNA 表达均较对照组降低，提示便秘时AQP9 mRNA 表达下调，导致肠道液体分泌减少，大便干结，排便困难;便秘组与对照组比较，升结肠AQP9 mRNA 表达有所下调，但经过统计学分析差异无统计学意义，而降结肠比较，差异有统计学意义，这说明降结肠具有重要的分泌功能。

以上研究提示，AQP4、AQP9 在肠道水代谢中具有重要的病理生理意义，其表达异常与肠道水代谢紊乱性疾病密切相关，进一步明确更多AQPs 与肠道水代谢异常疾病的关系，针对AQPs 的异常表达，研发相关的靶向药物有望成为今后治疗肠道水代谢紊乱性疾病的方向。

［1］ Ikarashi N，Mochiduki T，Takasaki A，et al. A mechanism by which the osmotic laxative magnesium sulphate increases the intestinal aquaporin 3 expression in HT-29 cells［J］. Life Sci，2011，88(3-4):194-200.

［2］ Magdeldin S，Li H，Yoshida Y，et al. Differential proteomic shotgun analysis elucidates involvement of water channel aquaporin 8 in presence of α-amylase in the colon［J］. J Proteome Res，2010，9(12):6635-6646.

［3］ Wang KS，Ma T，Filiz F，et al. Colon water transport in transgenic mice lacking aquaporin-4 water channels［J］. Am J Physial Gastrointest Liver Physiol，2000，279(2):G463-G470.

［4］ Xu DQ，Yu BP，Gao S，et al. The influence of Bianmining on the bowel movement of mice with constipation［J］. Chin J Gastroenterol Hepatol，2006，15(3):295-296.许东强，余保平，高山，等. 便秘宁对便秘小鼠排便作用的影响［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2006，15(3):295-296.

［5］ Li YP，Cui SH，Jiang T，et al. Development of constipation model of mice［J］. Chinese Journal of Food Hygiene，2000，12(1):1-4.李业鹏，崔生辉，江涛，等. 小鼠便秘模型的建立［J］. 中国食品卫生杂志，2000，12(1):1-4.

［6］ Lee-Robichaud H，Thomas K，Morgan J，et al. Lactulose versus polyethylene glycol for chronic constipation［J］. Cochrane Database Syst Rev，2010，(7):CD007570.

［7］ Hardin JA，Wallace LE，Wong JF，et al. Aquaporin expression is downregulated in a murine model of colitis and in patients with ulcerative colitis，Crohn's disease and infectious colitis［J］. Cell Tissue Res，2004，318(2):313-323.

［8］ King LS，Yasui M. Aquaporins and disease:lessons from mice to humans［J］. Trends Endocrinol Metab，2002，13(8):355-360.

［9］ Okada S，Misaka T，Matsumoto I，et al. Aquaporin-9 is expressed in a mucus-secreting goblet cell subset in the small intestine［J］. FEBS Lett，2003，540(1-3):157-162.