免疫增强剂对新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗抗体水平影响

袁 野，李守湖，李浩鹏，邢小勇，温峰琴，包世俊，胡永浩★(.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；.中牧股份（乾元浩生物股份有限公司），河南 郑州 450000)

免疫增强剂对新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗抗体水平影响

袁 野1，2，李守湖1，李浩鹏2，邢小勇1，温峰琴1，包世俊1，胡永浩1★
(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；2.中牧股份（乾元浩生物股份有限公司），河南 郑州 450000)

本研究旨在通过将不同种免疫增强剂与正常抗原含量及减量抗原含量的新城疫（La Sota株），禽流感（H5N1亚型Re-6株、Re-7株）5倍浓缩抗原按一定比例混合，制备成新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗，分别免疫SPF鸡。同时用不加免疫增强剂的新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗免疫SPF鸡作为对照组。结果表明，通过监测鸡免疫后不同天数的血清抗体水平，经方差分析得知，相比于对照组的抗体水平，其中添加有囊素多肽、黄芪多糖、灰树花多糖的疫苗免疫鸡后产生的抗体水平均呈显著提高，而香菇多糖与猪苓多糖则与对照组无显著性差异。结果提示，在抗原含量正常或减量的情况下，囊素多肽、黄芪多糖、灰树花多糖能起到抗体增强的效果，使其达到既能增强抗体又能降低成本的实用效果。

免疫增强剂；新城疫-禽流感；二联三价灭活疫苗；抗体滴度

新城疫（Newcastle disease，ND）和禽流感（Avian influenza）是危害禽类的重大疾病，其病原分别是新城疫病毒和禽流感病毒，都属于高度接触性传染病，给世界养禽业造成了巨大的经济损失[1-3]。目前，新城疫和禽流感的预防主要是接种疫苗[4-5]，鸡新城疫疫苗主要有弱毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、基因工程苗[6-7]，而弱毒疫苗为目前市场上最常见的疫苗。禽流感现阶段常见的疫苗为全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、重组活载体疫苗[8-9]。虽然使用常规疫苗免疫接种可以防制新城疫、禽流感，但在实际情况下常规单苗存在免疫繁琐、免疫效果不尽理想、成本高等缺点，针对市场的需求，进而研制出既节约成本又增强免疫效果的免疫增强剂。

免疫增强剂即广义上的佐剂，都是通过调动免疫系统的功能，提高机体的病原微生物的特异性反应来发挥其作用，是治疗和预防疾病的重要物质，特别是对疫苗发挥保护性作用起独特的效果，能有效影响免疫反应的质量（型的控制、局部免疫以及细胞类型的控制），稳定、便宜而且容易生产和保存[10-11]。本研究所用到的多种免疫增强剂，涉及小分子多肽类、多糖类等免疫增强剂能显著提高机体免疫系统功能，增强疫苗的免疫效果，减少疾病发生[12-13]。探讨各种免疫增强剂对鸡体感染新城疫，禽流感的免疫调节作用，为应对新城疫、禽流感能够达到更加理想的免疫预防奠定了理论依据。

1 材料与方法

1.1 抗原及试验动物抗原由乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂提供，包括新城疫（La Sota株）5倍浓缩抗原HA为11 log2，禽流感Re-7株5倍浓缩抗原HA为10 log2，禽流感Re-6株5倍浓缩抗原HA为10 log2。125只SPF鸡（28日龄）均由乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂动物房SPF种蛋孵化。

1.2 主要试剂及仪器囊素三肽购自上海淘普生物科技有限公司。黄芪多糖、香菇多糖、猪苓多糖、灰树花多糖均购自浙江方格药业有限公司。注射用白油由法国MARCOL52注射白油提供。硬脂酸铝购自上海远航试剂厂。司本-80和吐温-80均购自广东省肇庆市超能实业有限公司。无菌检验培养基由乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂提供。台式微型剪切机T-18型购自德国IKA公。LS900激光颗粒粒度分析仪购自青岛欧美克公司。八道移液器购自德国艾本德公司。

1.3 水相的制备①将1组事先配制好的囊素三肽溶液加入事先配置好的水相中；使浓度达到每1 000 mL疫苗中含囊素三肽10 mg，囊素三肽含量达到1%。②将2组黄芪多糖、3组灰树花多糖、4组香菇多糖、5组猪苓多糖原粉按一定比例溶于注射用水中制成相对应的黄芪多糖、灰树花多糖、香菇多糖、猪苓多糖溶液加入事先配置好的水相中，使其浓度达到疫苗总量的3%。

1.4 油相的制备将注射用白油、司苯-80、硬脂酸铝按一定比例经高压灭菌混匀制成油相。

1.5 乳化将配制好的油相先与含有囊素三肽的水相用德国IKAT18型高速剪切机先进行预乳化，待将水相加入完全后，按一定转速、时间乳化结束，分装于100 mL瓶中备用动物试验。分别将预先配置好的含有黄芪多糖的水相、灰树花多糖水相、猪苓多糖水相、香菇多糖水相溶液经高压灭菌后按一定比例加入5倍浓缩灭活抗原充分混匀后，缓缓加入油相，用德国IKAT18型高速剪切机预乳，待将水相加入后，按一定转速，时间乳化结束，分装于100 mL瓶中备用动物试验。

1.6 剂型取1清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，应呈油滴状不扩散。

1.7 稳定性取10 mL疫苗于离心管中，经3 500 r/min离心15 min，应不出现分层现象；疫苗在37℃左右条件，放置21 d不应有破乳现象。

1.8 黏度用下口内径为1.2 mm、上口内径为2.7 mm的1 mL移液吸管在25℃左右的条件下吸取疫苗1 mL，令其垂直流出，记录流出0.4 mL所需的时间。

1.9 颗粒度取5 μL疫苗混匀于10 mL白油中，置于LS900激光粒度分析仪中检测。

1.10 无菌检验疫苗抽样，分别取硫乙醇酸盐培养基2支，琼脂培养基2支，葡萄糖培养基1支，每支接种疫苗0.2 mL分别放置于37℃、25℃培养箱中做无菌检验。

1.11 效力检验28日龄SPF鸡125只分为12组，每组10只；第1～5组免疫添加含免疫增强剂及含有正常抗原含量的新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗0.3 mL；第6组免疫添加不含免疫增强剂及含有正常抗原含量的新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗0.3 mL；第7～11组免疫添加含免疫增强剂及含有1/5正常抗原含量的新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗0.3 mL；第12组免疫添加不含免疫增强剂及含有1/5正常抗原含量的新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗0.3 mL；另取5只作为空白对照。分别在免疫后的第14、21、28天采血收集血清，检测抗体，经spss对各个数据的方差分析统计。

2 结果

2.1 检验结果

2.1.1 疫苗物理性状及无菌检验

2.1.2 抗体检测结果 见表1。

表1 疫苗物理性状及无菌检验结果Table1 sterility test results and physical properties of Vaccine

2.2 数据分析

2.2.1 抗原正常含量的情况下（Re-6株） 在14 d、21 d时相比于对照组的抗体水平，黄芪多糖组与灰树花多糖组均极显著提高，囊素多肽组显著提高，而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。在28 d时相比于对照组的抗体水平，囊素多肽组、灰树花多糖组均极显著提高，黄芪多糖组显著提高，香菇多糖组、猪苓多糖组均与对照组无显著性差异。

2.2.2 抗原含量为正常含量1/5的情况下（Re-6株）在14 d时相比于对照组的抗体水平，囊素多肽组，黄芪多糖组与灰树花多糖组均极显著提高，而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。在21 d、28 d时相比于对照组的抗体水平，黄芪多糖组与灰树花多糖组均极显著提高，囊素多肽组显著提高，而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。

表2 免疫后各组的Re-6 HI抗体水平方差分析表Table2 Analysis of variance on Re-6 HI antibody case of each group after immunizating

表3 免疫后各组的Re-7 HI抗体水平方差分析表Table3 Analysis of variance on Re-7 HI antibody case of each group after immunizating

2.2.3 在抗原正常含量的情况下（Re-7株） 在14 d时相比于对照组的抗体水平，黄芪多糖组与灰树花多糖组均极显著提高，囊素多肽组显著提高，而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。在21 d时相比于对照组的抗体水平，黄芪多糖极显著提高，囊素多肽组与灰树花多糖组均显著提高，而香菇多糖与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。在28 d时相比于对照组的抗体水平，囊素多肽组、黄芪多糖组与灰树花多糖组均极显著提高，而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。

表4 免疫后各组的La Sota HI抗体情况水平方差分析Table4 Analysis of variance on La Sota HI antibody case of each group after immunizating

2.2.4 在抗原含量为正常含量1/5的情况下（Re-7株） 在14 d、21 d时相比于对照组的抗体水平，黄芪多糖组与灰树花多糖组均极显著提高，囊素多肽组显著提高，而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。在28 d时相比于对照组的抗体水平，囊素多肽组与黄芪多糖组均显著提高，灰树花多糖组显著提高，香菇多糖组与猪苓多糖均无显著提高。

2.2.5 在抗原正常含量的情况下（La Sota株） 在14 d时相比于对照组的抗体水平，囊素多肽组、黄芪多糖组与灰树花多糖组均极显著提高，而香菇多糖与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。在21 d时相比于对照组的抗体水平，灰树花多糖组极显著提高，囊素多肽组与黄芪多糖组显著提高，香菇多糖组与猪苓多糖组均无显著提高；在28 d时囊素多肽组、黄芪多糖组与灰树花多糖组均极显著提高，而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。

2.2.6 在抗原含量为正常含量1/5的情况下（La Sota株） 在14 d、21 d时相比于对照组的抗体水平，囊素多肽组、黄芪多糖组与灰树花多糖组均极显著提高，而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。在28 d时囊素多肽组、黄芪多糖组、灰树花多糖组、香菇多糖组与猪苓多糖组均无显著提高。

3 讨论

疫苗物理性状方面，囊素三肽组疫苗的颜色无改变，呈乳白色，无分层现象，黏度、颗粒度也和普通疫苗无明显差异，但黄芪多糖、灰树花多糖、香菇多糖、猪苓多糖组疫苗颜色均有不同程度的改变，黏度、颗粒度也有不同程度的增加，并且在高速离心后稳定性不理想，并且伴有沉淀析出。

相比于对照组的抗体水平，在抗原含量正常情况下，其中，添加有囊素多肽、黄芪多糖、灰树花多糖的疫苗免疫鸡后产生的抗体水平均呈显著提高，而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。且在抗原含量减量的情况下其中添加有囊素多肽、黄芪多糖、灰树花多糖的疫苗免疫鸡后产生的抗体水平相比于添加香菇多糖、猪苓多糖及未添加免疫增强剂的抗体水平呈显著提高，使其达到既能增强抗体又能降低成本的实用效果。

综合以上疫苗物理性状与抗体水平的分析结果来看，囊素三肽比较适合做新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗的免疫增强剂。

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2016年《现代畜牧兽医》杂志征订启事

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Study on immunostimulants on newcastle disease and avian influenza affected trivalent inactivated vaccine antibody levels

Yuan Ye1,2,Li Shouhu1,Li Haopeng2,Xing Xiaoyong1, Wen Fengqin1,Bao Shijun1,Hu Yonghao1*
(1.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Gansu Lanzhou 730070; 2.China Animal Husbandry Industry CO.,LTD/QYH Biotech Company Limited),Henan Zhengzhou 450000)

The study was designed by the different types of immune enhancer and normal antigen content and the reduction of the antigen content of Newcastle(La Sota strain),avian influenza A (H5N1 Re-6 strain and Re-7 strain)five times concentrated antigen mixed in certain proportions prepared Newcastle and avian influenza trivalent inactivated vaccine,SPF chickens were immunized.At the same time,as a control group with Newcastle disease without immune enhancer and avian influenza trivalent inactivated vaccine SPF chickens.The results showed that the serum antibody levels by different days after immunizating monitoring chicken.Analysis of variance that comparing to the antibody levels between the control group,the antibody levels of produced with vaccine add Bursin polypeptides,APS and grifolan showed a significant increase.However,the group with Lentinan and PUPS was no significant difference between the control group.The results suggests that immunopotentiator with Bursin polypeptides,APS and grifolan can play an enhanced effect of the antibody in the case of reduction or normal on the antigen content,it is also enhance antibody but to reduce the cost of economic effect.

Immunostimulants;Newcastle and avian influenza;Duplex trivalent inactivated vaccine;Titer of antibody

S858.31

1672-9692(2015)12-0001-06

2015-11-23

袁野（1983-），男，河南郑州人，博士研究生，主要从事生物制品、药品的研发与生产。

胡永浩（1962-），男，教授，博士生导师，主要从事动物传染病学及病原分子生物学的研究。