禽流感常见不同亚型间血凝抑制试验研究

闫海滨，薛树山，王宏燕，石 霖，李晓楠，何 欣，高 原（1.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳 110164；2.辽宁省动物医学研究院，辽宁 沈阳 110164）

禽流感常见不同亚型间血凝抑制试验研究

闫海滨1，2，薛树山1，2，王宏燕1，2，石 霖1，2，李晓楠1，2，何 欣1，2，高 原1，2
（1.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳 110164；2.辽宁省动物医学研究院，辽宁 沈阳 110164）

本研究通过对禽流感不同亚型间交叉血凝抑制试验（HI），分析其常见不同亚型及同一亚型不同毒株间HI交叉反应情况。试验结果表明，禽流感H5、H7和H9亚型中HI交叉保护极低，甚至可以忽略不计，而同一亚型不同毒株间HI交叉反应也表现出较大差异。H5Re-4抗原与H5Re-6、H5Re-7血清HI交叉反应为40%；H5Re-6抗原与Re-4 HI交叉反应约为77.8%，与H5Re-7血清HI交叉反应仅为11%；H5Re-7抗原与H5Re-4血清HI交叉反应约为77.8%，与Re-6血清HI交叉反应约为55.6%。H7N9抗原与与H7 HI交叉反应约为88.9%，而H7抗原与H7N9 HI交叉反应约为71%。上述数据表明，禽流感免疫时不同亚型的禽流感疫苗并不能互相代替，即使同一亚型不同株疫苗（如H5Re-6与Re-7株疫苗）由于免疫特异性关系也需要采取针对性疫苗免疫措施。

禽流感；亚型；HI试验

禽流感（Avian influenza，AI）是由A型流感病毒引起的一种禽类急性高度接触性传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟[1]。被世界动物卫生组织（OIE）定为A类传染病。依据其外膜血凝素（H）和神经氨酸酶（N）蛋白抗原性的不同，分为16个H亚型（H1～H16）和9个N亚型（N1～N9）[2]。H亚型临床常见主要有H5、H7及H9亚型，各亚型间免疫具有特异性[3]。目前研究表明，由于抗原漂移和抗原转变的原因即使H5同一亚型不同毒株间也存在着免疫特异性，给其防控工作带来了很大难度[4]。本研究主要通过HI试验，分析其不同亚型及同一亚型不同毒株间抗体交叉反应情况，为临床科学用苗提供科学依据。

1 试验材料

1.1抗原

1.1.1 H5N1抗原 Re-4抗原，批号:2012002；Re-6抗原，批号:2013004；Re-7抗原，批号:2014009。

1.1.2 H7抗原 H7抗原，批号:2014001；H7N9抗原，批号:2013003。

1.1.3 H9抗原 H9抗原，批号:2013002。

1.2阳性血清

1.2.1 H5N1标准阳性血清 H5N1 Re-4标准阳性血清，批号:2012001；Re-6标准阳性血清，批号: 2014001；Re-7标准阳性血清，批号:2014003。

1.2.2 H7标准阳性血清 H7标准阳性血清，批号: 2013002；H7N9标准阳性血清，批号:2013001。

1.2.3 H9标准阳性血清 H9标准阳性血清，批号: 2013001。

以上材料皆购自哈尔滨维科生物技术开发公司。

2 试验方法

2.1 抗原的标定抗原标定方法按GB/T18936-2003中微量血凝（HA）试验技术执行。结果判定，将反应板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌，完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。根据标定结果配制4个单位的抗原（HAU）。

2.2 交叉血凝抑制试验分别用4 HAU的H5、H7及H9抗原分别对各标准阳性血清（各设2组）进行HI试验。结果判定，以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。

3 试验结果

3.1 抗原标定结果6种抗原标定结果详见表1。

表1 6种抗原标定结果Table1 The calibration results of six kinds of antigens

表2 H5Re-4等6种抗原与6种标准阳性血清HI试验结果Table2 The HI test results of H5Re-4.etc antigen and six kinds of standard positive serum

3.2 交叉血凝抑制试验结果H5、H7及H9抗原与标准阳性血清HI试验结果详见表2。

3.2.1 H5抗原与标准阳性血清HI试验结果 H5Re-4抗原与H7、H7N9及H9标准阳性血清没有抗体交叉反应，与H5Re-6、Re-7血清抗体交叉反应也仅有40%。 H5Re-6抗原与H7、H7N9及H9标准阳性血清没有抗体交叉反应，与Re-4抗体交叉反应约为77.8%，但仍低2倍；与H5Re-7血清抗体交叉反应仅为11%。H5Re-7抗原与H7、H7N9及H9标准阳性血清没有抗体交叉反应，与H5Re-4血清抗体交叉反应约为77.8%，与Re-6血清抗体交叉反应约为55.6%。

3.2.2 H7N9抗原与标准阳性血清HI试验结果 H7N9抗原与H5Re-4、Re-6、Re-7及H9标准阳性血清没有交叉反应，与H7抗体交叉反应约为88.9%。H7抗原与H5Re-4、Re-6、Re-7及H9标准阳性血清没有交叉反应，与H7N9抗体交叉反应约为71%。

3.2.3 H9抗原与标准阳性血清HI试验结果 H9抗原与H5Re-4、Re-6、Re-7及H7标准阳性血清交叉反应HI值全部＜4，与H7N9无抗体交叉反应。

4 讨论

4.1禽流感不同亚型间免疫交叉保护力较低，即使同一亚型（如H5亚型）不同毒株由于抗原漂移等原因也存在着免疫特异性[5]。本试验研究结果表明，禽流感H5、H7和H9不同亚型间抗体交叉反应极低，甚至可以忽略不计，而同一亚型不同毒株间抗体交叉反应也表现出较大差异。

4.2本试验中H5亚型禽流感交叉血凝抑制反应表明，经典的H5Re-4株与现今使用的Re-6、Re-7株抗体交叉反应仅为40%，这也从血清学上说明原有的H5Re-4株疫苗对H5Re-6、Re-7株不能完全起到抗体交叉保护作用。而H5Re-6株对Re-7株抗体交叉反应几乎没有，但H5Re-7株对Re-6株有部分抗体交叉反应。H5Re-6株、Re-7株对Re-4株有相对较高的抗体交叉反应。

4.32013年上海、安徽等地出现新型重配H7N9禽流感病毒人病例[6]后，我国开始使用H7N9抗原对家禽进行血清学监测，与传统H7抗原相比，二者检测结果并不完全一致。本试验中H7与H7N9抗体交叉反应试验也证明这一点。传统的H7抗原对H7N9阳性血清抗体交叉反应约为71%，而H7N9抗原对H7血清抗体交叉反应达88.9%。

4.4A型禽流感病毒亚型众多，亚型间免疫交叉保护情况说法不一，但从禽流感常见不同亚型间交叉HI试验研究结果看，H5、H7及H9亚型间抗体交叉反应很低，即使同一个亚型不同毒株间抗体交叉反应也存在很大差异。因此，就目前来说，禽流感免疫时不同亚型的禽流感疫苗并不能互相代替，即使同一亚型不同株疫苗（如H5Re-6与Re-7株疫苗）由于免疫特异性关系也需要采取针对性疫苗免疫措施。

[1]Morens DM,Taubenberger JL.Historical thoughts oninfluenzaviralecosystems,orbeholda pale horse, dead dogs, failing fowl, and sick swine[J]. Influenza Other Respi Viruses,2010,4:327-337.

[2]Fouchier RA,Munster V,Wallensten A,et al. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls[J].J.Virol,79:2814–2822.

[3]李静，白玉梅.禽流感流行与防制现状[J].山西师范大学学报(自然科学版)，2004，03：98-102.

[4]熊正慧.我国某地H5亚型禽流感分子流行病学调查及变异分析[D].武汉：华中农业大学，2013.

[5]曾显营，钟功勋，李雁冰，等.禽流感病毒H5N1变异株灭活疫苗(Re-4株)对鸡、鸭和鹅的免疫效果研究[J].中国预防兽医学报，2010，10：800-803.

[6]石霖，吴运谱，闫海滨，等.动物H7N9禽流感荧光RTPCR检测技术[J].现代畜牧兽医，2013，05：22-24.

Study on the cross-hemagglutination inhibition test of different Avian Influenza subtypes

Yan Haibin1，2,Xue Shushan1，2,Wang Hongyan1，2,Shi Lin1，2, Li Xiaonan1，2,He Xin1，2,Gao Yuan1，2
（1.Liaoning Center for Animal Disease Control and Prevention,Liaoning Shenyang 110164; 2.Animal medicine research institute of Liaoning province,Liaoning Shenyang 110164)

The aim of this study is to evaluate the HI cross-reactivity of H5、H7 and H9 avian influenza subtypes and different strains of the same subtypes.The results showed that the H5,H7 and H9 had a very low HI cross reaction between different subtypes,and the HI reaction between different strains of the same subtype showed great differences.The HI cross response of H5Re-4 antigen and H5Re-6,H5Re-7 positive serum was 40%;H5Re-6 antigen and H5Re-4 positive serum was 77.8%,and H5Re-7 positive serum was 11%;H5Re-7 antigen and H5Re-4 and H5Re-6 positive serum were 77.8%and 55.6%.The HI cross reaction of H7N9 antigen and H7 positive serum were 88.9%,on the contrary H7 and H7N9 were 71%.The data suggested that avian influenza vaccine can not be replaced,even if vaccine with the same subtype but different strains(such as H5Re-6 and Re-7 vaccine)also need a targeted vaccine immune measures.

Avian influenza;Subtype;HI test

S852.65

B

1672-9692(2015)12-0035-03

2015-10-21

闫海滨（1973-），女，本科，兽医师，主要从事禽病的检测与研究。