轻度认知功能障碍患者尿液生物标志物

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轻度认知功能障碍患者尿液生物标志物

李乃静李伟1何平

(中国医科大学附属盛京医院老年病科，辽宁沈阳110004)

摘要〔〕目的探讨轻度认知功能障碍(MCI)患者尿液中潜在的生物标志物。方法通过超高效液相色谱-质谱联用和代谢组学的方法，考查MCI患者和正常老年人尿液中代谢产物的扰动。对于超高效液相色谱-质谱联用所产生的色谱图，进行主成分分析显示出疾病组和正常组之间的代谢物的变化。结果MCI患者的鞘氨醇类相对于正常组变化明显，5个潜在的与MCI相关的生物标志物被发现。结论MCI患者的代谢物谱发生了明显改变，这可以为MCI的诊断提供依据。

关键词〔〕轻度认知功能障碍;尿液;标志物

中图分类号〔〕R749.1〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81203002)；沈阳市科技局课题(No.F12-193-9-22)

1沈阳药科大学药分教研室

第一作者：李乃静(1972-)，女，博士，副教授，主要从事老年病研究。

Urine metabolic profiling of mild cognitive impairment

LI Nai-Jing,LI Wei,HE Ping

Department of Gerontology,Shengjing Affiliated Hospital,China Medical University,Shengyang 110004,Liaoning,China

Abstract【】ObjectiveTo explore potential biomarkers in urine for mild cognitive impairment(MCI).MethodsUrine metabolic perturbations between MCI and healthy old person were investigated by using ultra performance liquid chromatography/mass spectrometry(UPLC/MS)and metabonomics approach.The principal component analysis(PCA)of UPLC/MS spectra showed that metabolic changes between two groups.ResultsThe PCA of UPLC/MS spectra showed that metabolic changes observed between MCI and control were clear.Five potential biomarkers in correlation with the extent of MCI were found.ConclusionsThe perturbation of phospholipids metabolism of MCI diseases may be important for clinical diagnosis and treatment.

【Key words】Mild cognitive impairment;Uine;Biomarkers

认知功能障碍性疾病主要包括阿尔茨海默病(AD)和轻度认知功能障碍(MCI)。在美国认知功能障碍性疾病每年至少造成10万人死亡，仅次于心脏病、癌症、脑卒中〔1〕。但目前尚不能对认知功能障碍性疾病早期诊断，更无有效的治疗措施。代谢组学是研究外源性物质对生物体产生的整体效应，并以生物体内物质分子的整体作为对象,通过核磁共振(NMR)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)等高通量、高分辨、高灵敏度的现代仪器分析手段，定性或定量研究生物体液中的代谢产物，研究药物对机体所形成代谢组的系统作用〔2,3〕。本研究采用代谢组学的方法，确定MCI患者的生物标志物。

1材料与方法

1.1试验仪器与试剂液相系统 Waters AcquityTMUltra Performance Liquid Chromatography(UPLC)system，美国 Waters 公司；质谱仪 Micromass Quattro microTMAPI 三重四级杆质谱仪 ，Waters 公司；高效液相-飞行时间质谱联用仪(HPLC-ESI- QTOF- MS)，德国 Bruker 公司；台式离心机(TGL-16C)，上海安亭科学仪器厂；高速台式冷冻离心机(TGL-16)，湘仪离心机仪器有限公司；振荡器CAY-1型液体快速混合器，北京长安仪器厂；微量取样器(200 μl) Proline单道可调移液器，上海科华实验系统有限公司；乙腈(色谱纯)，甲醇(色谱纯)美国 Fisher公司。

1.2试验对象本研究选取中国医科大学附属盛京医院MCI患者(MCI组)和健康的老年志愿者(对照组)各20例，MCI组男10例，女10例，平均年龄(70±11)岁，体重指数(BMI)(26.5±2.2)kg/m2；对照组男10例，女10例，平均年龄(24.2±1.9)岁，BMI(24.2±1.9)kg/m2。本研究遵照《赫尔辛基宣言》的原则实施。健康老年受试者没有神经和认知的疾病。

1.3试验方法

1.3.1尿样采集与预处理采取MCI患者和健康的老年志愿者的晨尿，约10 ml/h，加叠氮化钠作为防腐剂，3 500 r/min离心10 min。取200 μl尿样加入1.5 ml EP管中,加入400 μl甲醇沉淀蛋白，在4℃的低温离心机中，15 000 r/min离心10 min,上清液转移至另一EP管中，保持30℃恒温，在N2气流下吹干，用100 μl甲醇复溶，复溶后转移至2 ml的进样瓶中，进样10 μl，用于UPLC-MS 分析。

1.3.2UPLC-MS代谢产物的图谱采集代谢组学研究需要对生物样品预处理，本实验中采取甲醇沉淀尿液中蛋白。质谱检测器采用正离子方式检测。MCI患者和健康的老年志愿者的尿样总离子流(TIC)色谱图见图1。

1.4UPLC-MS测定的方法学确证在分析实验样品之前，需要进行方法确证。考查仪器的精密度，日内稳定性，方法的重复性。计算峰强度和峰保留时间的相对标准差(RSDs)。 仪器精密度：相同的样品连续进5针，保留时间的RSDs从0.05%～0.45%，峰强度的RSD从2.5%～8.5%。处理后样品稳定性，通过分析一份样品处理后，放置于保持在4℃的自动进样器中，考察0，4，8，12，24 h的稳定性,每个时间点进一针，结果显示峰强度的 RSDs 从2.6%～8.5% ，保留时间的RSDs从0.05%～0.46%，表明方法精密度良好。

图1　两组研究对象尿样TIC色谱图

1.5数据分析和生物标志物的鉴定将原始图谱导入 Markerlynx 软件进行分析处理，设置主要分析参数，进行主成分分析(PCA)。主要参数设置如下：质谱的质量数误差：0.01 D；噪音消除水平：10.0；初始和结束保留时间分别为0和20 min；低，高分子量分别设置成100，900 amu。从全扫描质谱图中来分析生物标志物并且作图。由碰撞诱导的裂解(CID)方式可以得到这些潜在生物标记物的裂解谱图。一些标记物通过与标准物质对比色谱峰保留时间和二级质谱碎片特征。这些代谢物的全扫描质谱图，通过查找可利用的生物化学数据库，例如KEGG，METLIN等得到解释。同时,一些生物标志物通过在相同液相条件下，对比在Bruker飞行时间质谱(ESI-QTOF-MS)上的保留时间和精确分子量来确认。

2结果

通过 PCA 分析，鉴定出了5个标志物。在正离子模式下，保留时间(min)和质荷比(m/z)成对出现:9.4_274.3，8.2_246.3，9.5_318.3，12.0_330.4，10.8_346.4。通过在Waters UPLC/MS/MS仪器上分析分子量和裂解碎片之后，进一步分析了来自Bruker ESI-QTOF-MS的精确分子量数据和二级裂解碎片。通过比较两者的一致性，查找 HMDB 和 KEGG 数据库，这一类化合物被分别鉴定为274.3：C16 DHS，246.3：C14 DHS，318.3：C18 PHS，330.4:C20 DHS，346.4:C20 PHS。其对应的保留时间与m/z的总结见表1。MCI组鉴定出的5个标志物的含量明显低于对照组，标志物含量的相对变化趋势见表2。

表1MCI组生物标记物代谢组学特征

保留时间(min)m/z代谢物精确分子量测定分子量MCIvs.对照组9.4274.3C16DHS2274.2746274.2742(1.6ppm)↓8.2246.3C14DHS2246.2433246.2427(2.6ppm)↓9.5318.3C18PHS2318.3008318.3002(2.0ppm)↓12.0330.4C20DHS2330.3372330.3362(3.1ppm)↓10.8346.4C20PHS2346.3321346.3322(0.2ppm)↓

表2MCI组和对照组峰强度比较

指标对照组MCI组C14DHS210.067.401)C16DHS230.7928.501)C18PHS219.3714.601)C20DHS214.8010.601)C20PHS29.277.001)

与对照组比较：1)P<0.05

3讨论

随着人类老龄化社会进程的加快，老年人认知功能障碍性疾病逐年增多，正确诊断和识别MCI，对早期干预、防止痴呆的发生有重要意义。据报道MCI性疾病在发病早期代谢物中的一些生物学标志物的改变早于临床症状的出现〔4〕。生物学标志物存在于脑脊液、血液和尿液等标本中，许多学者研究了脑脊液内可能的标志物，主要集中在Aβ蛋白、总Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白，检测手段多为酶联免疫吸附试验和蛋白组学技术〔5，6〕，运用代谢组学技术来探索认知功能障碍性疾病生物标志物的研究鲜见报道。代谢组学是对限定条件下的特定生物样品中所有代谢产物的定性定量分析，多应用于植物和微生物领域研究细胞的代谢组学。代谢组学技术能够将基因和蛋白质表达的微小变化在代谢物上放大，从而使检测更为容易，研究的样品主要包括尿液、血液、唾液以及细胞或组织的提取液等。目前对认知功能障碍患者尿液代谢组学的研究国内尚未见报道。

本实验结果表明MCI患者尿液中确定的生物标志物为5种神经鞘氨醇类化合物。鞘脂类及其衍生物鞘氨醇、 神经酰胺和双氢鞘氨醇,被认为是重要的信号分子，介导了许多生物学功能，例如细胞生长、分化、老化和程序性死亡〔7〕。研究发现,当人成纤维细胞进入衰老阶段时,其内源性神经酰胺水平特异性显著升高。同时这些细胞中的中性鞘磷脂酶的活性也提高〔8〕。在细胞中加入外源性神经酰胺可诱导这些细胞发生与衰老细胞类似的形态学改变。 因此,神经酰胺的形成可代表着一条特殊的细胞老化信号途径。由此鞘氨醇类物质的变化可作为AD的生物标志物。近年来,利用具有细胞毒作用的药物尤其是天然药物甚至是膳食干预的途径对老年痴呆的防治,已经愈来愈受到人们的重视,给大鼠食用神经酰胺或者其衍生物，对于大鼠在认知、学习、记忆方面的脑部功能均有有利的作用〔9〕。随着鞘脂质及其代谢物与细胞凋亡相互关系究的明确及其相关理论的建立,利用富含鞘脂类物质的食物及其强化食品或直接以药剂的形式进行预防和治疗相关疾病必将成为可能。

本实验将代谢组学的方法运用于认知功能障碍性疾病的研究，确定轻度认知功能障碍代谢物中特异、可靠的生物标志物；明确认知功能障碍严重程度与生物标记物的含量的相关性。总结认知功能障碍性疾病内源性代谢物变化的规律，为认知功能障碍性疾病的特异性诊断提供科学支撑和新的理论依据，并为代谢组学的临床应用研究探索新思路。

4参考文献

1Goedert M,Spillantini MG.A century of Alzheimer’s disease〔J〕.Science,2006；314(5800):778-81.

2Lindon JC,Holmes E,Nicholson JK.Metabonomics and its role in drug development and disease diagnosis〔J〕.Expert Rev Mol Diagn,2004;4(3):189-99.

3Lindon JC,Holmes E,Nicholson JK.So what's the deal with metabonomics〔J〕.Anal Chem,2003;75(17):384A-91.

4Lopez OL.Mild congnitive impairment〔J〕.Continuum,2013;19(2):411-24.

5姚洁，王培昌.脑脊液生物学标志物的检测在阿尔茨海默病诊断中的应用〔J〕.中国老年学杂志,2007;27(16)：1631-5.

6Simonsen AH，Hansson SF，Ruetschi U.Amyloid beta1～40 quantification in CSF:comparison between chromatographic and immunochemical methods〔J〕.Dement Geriatr Cogn Disord,2007;23(4):246-50.

7Hu W,Xu R,Zhang G,etal.Golgi fragmentation is associated with the ceramide-induced cellular effects〔J〕.Mol Biol Cell,2005;16(3):1555-67.

8Beckonert O,Keun HC,Ebbels TM,etal.Metabolic profiling,metabolomic and metabolomic procedures for NMR spectroscopy of urin,plasma,serum and tissue extracts〔J〕.Nat Protoc,2007;2(11):2692-703.

9Shi YQ,Huang TW,Chen LM,etal.Ginsenoside-Rg1 attenuates amyloid-beta content regulates PKA/CREB activity and improves cognitive performance in SAMP8 mice〔J〕.J Alzheimers Dis,2010;19(3):977-89.

〔2014-05-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

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