丝胶对Fas介导的糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡的保护作用

丝胶对Fas介导的糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡的保护作用

刘东波魏萌张艳乔跃兵陈志宏

(承德医学院，河北承德067000)

摘要〔〕目的观察丝胶对2型糖尿病大鼠血糖、胰岛形态结构、胰岛细胞中胰岛素及胰岛β细胞细胞质死亡受体(Fas)表达的作用。方法48只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、糖尿病模型组、二甲双胍组、丝胶治疗组，每组12只。采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病动物模型,成模后，丝胶治疗组和二甲双胍组大鼠分别给予丝胶(2.4 g·kg-1·d-1)和二甲双胍(55.33 mg·kg-1·d-1)灌胃。给药4 w后禁食12 h，麻醉后取血，全自动生化分析仪检测大鼠空腹血糖(FPG)；常规HE染色普通光镜下观察胰岛的形态结构和免疫组织化学染色法观察胰岛细胞中胰岛素表达情况；免疫组织化学染色法观察胰岛β细胞细胞质Fas蛋白的表达情况。结果①与正常对照组相比，模型组大鼠FPG明显升高(P<0.01);与模型组比较，丝胶治疗组和二甲双胍组FPG明显降低(P<0.01)；②与正常对照组相比，模型组胰岛萎缩、轮廓欠圆润、边缘不规则，胰岛细胞数量减少且分布稀疏而不均匀，胰岛素表达水平下降(P<0.05)；与模型组比较，丝胶治疗组和二甲双胍组大鼠胰岛细胞数量增多，分布也比较致密，胰岛素表达水平上升(P<0.05)；③与正常对照组相比，模型组Fas蛋白的表达明显降低(P<0.05)，与模型组比较，丝胶治疗组和二甲双胍组Fas蛋白的表达明显升高(P<0.05)。以上指标丝胶治疗组和二甲双胍组比较均无明显差异(P>0.05)。结论丝胶对2型糖尿病具有治疗作用，其机制可能与抑制Fas介导的胰岛β细胞凋亡有关。

关键词〔〕2型糖尿病；丝胶；胰岛素；Fas

中图分类号〔〕R587〔文献标识码〕A〔

基金项目：河北省自然科学

通讯作者：乔跃兵(1965-)，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事神经内分泌方面研究。

第一作者：刘东波(1986-)，男，硕士，主要从事内分泌方面研究。

目前全球有糖尿病患者2.85亿，中国糖尿病人群数量可占到全球的1/3，而其中90%以上为2型糖尿病〔1〕。2型糖尿病是遗传和环境因素共同作用的多基因复杂性疾病，其病理机制为β细胞功能受损和胰岛素抵抗，二者在2型糖尿病发生发展中到底谁是首要原因尚存在异议，最近的研究开始重视胰岛β细胞功能受损在糖尿病病程发展中的作用〔2〕。胰岛β细胞的数量决定分泌胰岛素的多少，β细胞凋亡增加可造成β细胞数量减少，最终导致胰岛素分泌不足和糖尿病〔3,4〕。最近的一项大规模尸检发现，糖耐量受损和2型糖尿病患者均存在β细胞数量的明显减少，2型糖尿病患者更为严重〔5〕。前期研究证明丝胶可通过上调抗凋亡基因Bcl-2表达和下调促凋亡基因Bax表达调节胰岛β细胞凋亡、增殖的平衡〔6〕。本研究探讨丝胶对糖尿病大鼠血糖、胰岛形态结构、胰岛细胞中胰岛素和胰岛β细胞凋亡相关蛋白Fas表达的影响。

1材料与方法

1.1药物和试剂丝胶由彩色蚕茧经浸泡、水煎、过滤、浓缩而成。链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司，用pH4.4的枸橼酸钠-枸橼酸缓冲液配成2%的溶液；盐酸二甲双胍，辽宁一成药业有限公司，临用时研成细末用蒸馏水配成溶液；血糖检测试剂盒，保定长城临床试剂有限公司；胰岛素小鼠抗大鼠单克隆抗体、Fas兔抗鼠多克隆抗体、免疫组化试剂盒，均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2实验动物的分组及处理清洁级雄性SD大鼠48只，由河北医科大学实验动物中心提供，合格证号：712024。大鼠随机分为正常对照组、糖尿病模型组、二甲双胍组、丝胶治疗组，每组12只。采用小剂量链脲佐菌素(STZ，25 mg/kg)连续腹腔注射，连续3 d，1 w后以血糖为≥16.7 mmol/L作为成模标准，待成模后，丝胶治疗组和二甲双胍组分别给予丝胶(2.4 g·kg-1·d-1)和二甲双胍(55.33 mg·kg-1·d-1)灌胃，连续35 d；正常对照组和模型组不作处理。

1.3检测血糖各组大鼠禁食12 h，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，经内眦于眶后静脉丛采血，京立LD4-2A离心机3 000 r/min，离心20 min，收集血清，使用日本日立公司的Boehringer Mannhein/Hitachi全自动临床生化分析仪采用葡萄糖氧化酶法检测血糖。

1.4胰岛的形态学观察大鼠取血后断头处死，取胰腺入Bouins液固定，常规石蜡包埋，连续切片，片厚5 μm。常规HE染色，光学显微镜下观察胰岛形态结构的变化并摄片。免疫组化染色及定量分析：SP免疫组化染色法观察胰岛细胞中胰岛素和胰岛β细胞Fas蛋白的表达，一抗稀释浓度胰岛素为1∶150，Fas为1∶100，阴性对照加等量PBS，DAB显色，苏木素复染，以胞质出现棕黄色颗粒为阳性反应。定量分析：使用Image-pro plus 6.0图像分析处理软件，在10×20倍显微镜下随机选取胰岛作为观察视野，计算阳性产物面积占胰岛面积的比值；每组随机选取5只大鼠，每只大鼠任选5张切片，每张切片选取3个胰岛，取平均值。

2结果

2.1各组大鼠血糖比较与正常对照组相比，模型组血糖显著升高(P<0.01)；与模型组相比，二甲双胍和丝胶治疗组血糖明显降低(P<0.01)；二甲双胍和丝胶治疗组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

组别血糖胰岛素β细胞正常对照组10.83±2.030.785±0.0630.150±0.016模型组二甲双胍组29.45±4.821)13.18±2.303)0.524±0.0862)0.684±0.0534)0.515±0.0422)0.318±0.0234)丝胶治疗组13.20±4.093)0.703±0.0344)0.359±0.0344)

与正常对照组比较:1)P<0.01，2)P<0.05；与模型组比较：3)P<0.01，4)P<0.05

2.2各组大鼠胰岛的形态结构正常对照组胰岛岛形丰满，轮廓清晰，到细胞分布紧密而均匀；模型组胰岛萎缩，轮廓欠圆润，边缘不规则，胰岛细胞数量减少且分布稀疏而不均匀；丝胶治疗组和二甲双胍组胰岛细胞数量均增多，分布也比较致密，丝胶治疗组与二甲双胍组胰岛形态变化差异不大。见图1。

图1　各组胰腺组织HE染色(×200)

2.3各组大鼠胰岛细胞中胰岛素的表达情况 光镜下正常对照组大鼠胰岛结构完整，比较饱满，边界清晰，胰岛素阳性颗粒经染色后为棕色,在胰岛中广泛分布；模型组大鼠胰岛缩小，边界不清，胰岛素表达水平下降(P<0.05)；二甲双胍组和丝胶治疗组大鼠胰岛增大，边界较清晰，胰岛素表达较模型组升高(P<0.05)，二者之间比较无明显差异。见图2。

图2　各组胰岛细胞中胰岛素表达情况(DAB，×200)

2.4各组大鼠胰岛β细胞Fas蛋白的表达Fas蛋白免疫阳性产物为棕色，位于细胞质，免疫阳性细胞主要为胰岛胰岛β细胞。与正常对照组相比，模型组Fas表达明显增加(P<0.05)；与模型组比较，丝胶治疗组和二甲双胍组Fas表达减少(P<0.05)；丝胶治疗组和二甲双胍组比较无统计学意义(P>0.05)。见图3，表1。

图3　各组胰岛β细胞细胞质Fas蛋白的表达(DAB，×200)

3讨论

胰岛β细胞凋亡造成的胰岛数量不足和胰岛功能受损在糖尿病的病程进展具有重要作用。如何保护残存的胰岛β细胞和减少凋亡来延缓糖尿病的进展，成为目前糖尿病研究的热点和难点〔7～9〕。

胰岛β细胞凋亡是一个非常复杂的生理和病理过程，是由自身内部机制调节的主动性、特定程序性的细胞自发性死亡方式。调控细胞凋亡的信号导通路主要有3条：死亡受体通路、线粒体通路及内质网通路〔10〕。最近研究显示，Fas所引起的胰岛β细胞凋亡是糖尿病的发病因素，属于死亡受体途径〔11,12〕。Fas与死亡受体配体(FasL)结合后传递细胞程序化死亡信息，产生有活性的半胱天冬蛋白酶(Caspase)-8，激发一系列Caspase下游的级联反应，从而诱发细胞凋亡〔13〕。

本研究结果表明丝胶可通过降低血糖，下调凋亡蛋白Fas的表达，减少胰岛细胞的凋亡，从而增加胰岛细胞胰岛素的表

达，使得相应的胰岛细胞数量增加，在一定程度上恢复胰岛的功能，因此丝胶对糖尿病具有一定的治疗作用。丝胶为天然高分子水溶性蛋白，由18种氨基酸组成，约占茧丝的30%，在缫丝和精炼时大部分被丢弃。丝胶具有低毒或无毒，副作用比较少，可明显促进胰岛再生、改善胰岛素抵抗且来源比较广泛。本研究进一步探索了丝胶保护胰岛细胞凋亡的内在机制，为充分利用丝胶提供了实验依据。

4参考文献

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〔2014-06-27修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)