热休克蛋白60在纳洛酮神经保护中的作用

热休克蛋白60在纳洛酮神经保护中的作用

丁斐嘉张楠马骄李凡张蕊李玲1李云鸿王银

(宁夏医科大学宁夏颅脑疾病重点实验室，宁夏银川750004)

摘要〔〕目的研究热休克蛋白(HSP)60在纳洛酮神经保护中的作用及机制。方法培养小胶质细胞株BV2，实验分为对照组、阳性对照组(细菌脂多糖，LPS)、实验组(LPS+纳洛酮)。利用Western印迹和免疫荧光技术检测不同分组中HSP60的表达，ELISA技术检测HSP60 的胞外释放。利用人重组HSP60(rhHSP60)作用于BV2细胞，然后用Western印迹技术检测不同分组中Toll样受体(TLR)-4的表达；收集细胞培养液，用ELISA检测肿瘤坏死因子(TNF)-α和γ-干扰素(IFN-γ)的水平。结果与对照组相比，阳性对照组中的HSP60和TLR-4表达及TNF-α和IFN-γ的释放都显著增加；而加入纳洛酮后，实验组中这些因子的水平都明显降低(P<0.05)。结论纳洛酮可能通过HSP60-TLR-4 途径阻止小胶质细胞的活化而发挥神经保护作用。

关键词〔〕热休克蛋白60；纳洛酮；TLR-4

中图分类号〔〕R285.5〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金(No.31260243)

通讯作者：王银(1973-)，女，教授，博士，硕士生导师，主要从事神经生物学研究。

The role of HSP60 in the neuroprotective effects of naloxone

DING Fei-Jia,ZHANG Nan,MA Jiao，etal.

Ningxia Medical Oniversity,Key Laboratory of Ningxia Province,Yinchuan 750004,Ningxia,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the function and possible mechanism of HSP60 in the neuroprotective effects of naloxone.MethodsCulturing BV2 cell line were cultured and devided into control,positive control and experimental groups.The expression of HSP60 in 3 groups was measured by Western blot and immunofluorescence technique. The extracellular release of HSP60 was detected by ELISA.The expression of TLR-4 was measured by Western blot after rhHSP60 in BV2 cell,and the releases of TNF-α and IFN-γ were observed by ELISA.ResultsCompared with those of control group,the expressions of HSP60,TLR-4,TNF-α and IFN-γ in positive control group were significantly increased,and their expressions were decreased in experimental group(P<0.05).ConclusionsNaloxone might through HSP60-TLR-4 signal path to inhibit the activation of microglia and play neuroprotective effects.

【Key words】HSP60;Naloxone;TLR-4

1银川市第一人民医院高压氧科

第一作者：丁斐嘉(1991-)，女，在读硕士，主要从事神经生物学研究。

纳洛酮是经典的阿片受体拮抗剂，可以阻断各种病理损害的最后通路，从而起到神经保护作用。在临床上纳洛酮常用于脑梗死、新生儿缺血缺氧性脑病等〔1〕。已有研究发现纳洛酮可以阻止小胶质细胞的活化〔2〕，但对其作用机制尚不清楚。热休克蛋白(HSP)60主要位于线粒体内，释放至胞外的HSP60可与细胞膜上的Toll样受体(TLR)-4受体结合导致细胞凋亡〔3〕。本研究旨在了解纳洛酮的神经保护作用与HSP60的关系。

1材料与方法

1.1材料HSP60抗体和人重组HSP60(rhHSP60)蛋白购自ENZO公司；TLR-4抗体购自Abcam公司；全蛋白提取试剂盒购自凯基公司；蛋白定量BCA试剂盒购自Thermo公司；DMEM培养基和胎牛血清为Hyclone公司产品；纳洛酮和LPS购自Sigma公司；ELISA试剂盒购自欣博盛公司；DAPI染色液购自碧云天公司。

1.2方法

1.2.1BV2小胶质细胞的培养BV2小胶质细胞在含10%胎牛血清的DEME培养基，37℃，5%CO2培养箱中培养。用无菌的0.01%PBS充分溶解纳洛酮。LPS(1 μg/ml)或rhHSP60(1 μg/ml)处理BV2小胶质细胞30 min后，分别加入1 μmol/L的纳洛酮溶液，孵育24 h后，收集细胞及上清液。

1.2.2Western印迹检测蛋白表达药物处理24 h后，用全蛋白提取试剂盒提取各组蛋白并收集上清液，用BCA法蛋白定量，取等量蛋白，10%SDS PAGE分离后将蛋白转至PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST封闭膜2 h，一抗4℃孵育过夜，TBST充分洗涤膜后用二抗室温孵育1 h，ECL试剂显色成像。以GAPDH作为内参照。

1.2.3ELISA检测细胞因子的表达应用ELISA试剂盒，按照试剂盒的操作步骤，分别测定各组培养液上清中的TNF-α、INF-γ的表达，最后在酶标仪上540 nm处测定各孔光密度值(OD)。

1.2.4免疫荧光染色技术24孔板中加入细胞爬片，然后培养对照组、阳性对照组(LPS)、实验组(LPS+纳洛酮)。24 h后用PBS清洗玻片，先用4%多聚甲醛常温固定，然后用含有1% Triton X-100透化处理，用封闭用正常羊血清37℃封闭60 min。用一抗稀释液(PBST稀释)4℃孵育过夜，后用PBS清洗玻片，用耦联有Alexa Fluor 594染料的二抗稀释液(PBST稀释)37℃孵育1 h，用PBS清洗玻片，最后用DAPI和Mount封片。共聚焦显微镜下观察。

2结果

2.1纳洛酮抑制LPS激活后的小胶质细胞中的HSP60表达图1可见，Western印迹结果显示，与对照组比较，LPS激活后的小胶质细胞中HSP60的表达明显上扬，而纳洛酮可显著抑制LPS引起的HSP60增加(P<0.05)。免疫荧光染色结果也证实小胶质细胞经LPS激活后，HSP60的信号明显增强，且荧光多分布于细胞膜上，而纳络酮减弱了HSP60的信号。ELISA 结果显示纳络酮处理后，由LPS引起的HSP60胞外释放量明显被降低。

A：Western印迹结果；B：ELISA检测细胞培养液中HSP60水平；C：免疫荧光染色显示HSP60表达 图1　纳洛酮对LPS激活的小胶质细胞中 HSP60表达和释放的抑制作用

2.2纳洛酮抑制rhHSP60刺激后的小胶质细胞中的TLR-4的表达Western印迹结果表明，与对照组比较，rhHSP60处理后的小胶质细胞中TLR-4的表达明显增加，在纳洛酮处理的实验组中，TLR-4的表达显著下降(P<0.05)(图2)。

2.3纳洛酮降低rhHSP60处理后的小胶质细胞的细胞因子的表达rhHSP60刺激后的BV2小胶质细胞中的TNF-α、INF-γ细胞因子的表达显著增加，而用纳洛酮处理后细胞因子的水平降低(P<0.05)(图3)。

图2　纳洛酮对rhHSP60处理后的 小胶质细胞中TLR-4的抑制作用

图3　纳洛酮对rhHSP60处理24 h后的小胶质 细胞中细胞因子TNF-α和INF-γ的抑制

3讨论

生理状态下，HSP60主要位于线粒体或细胞质中，对细胞具有抗凋亡和保护作用；然而病理状态下，HSP60表达水平变化，亚细胞定位发生改变，主要位于细胞膜甚至分泌到胞外，则可促进细胞凋亡。Lin等〔4〕报道心力衰竭的心肌细胞中HSP60的表达和定位发生了改变，认为HSP60 与心肌细胞的凋亡有关。Kim等〔3〕的研究发现心肌细胞胞外的HSP60 是TLR-4的配体，可以通过与TLR-4结合激活细胞凋亡通路。

小胶质细胞是中枢神经系统的免疫细胞，受到感染、外伤等因素刺激后活化，产生多种免疫效应分子介导慢性炎症反应、细胞凋亡等，是导致神经系统退行性病变如老年痴呆、帕金森病等的主要因素〔5〕。小胶质细胞的细胞膜上也存在着TLR-4受体〔6〕，因此我们推测小胶质细胞激活后高度表达HSP60，并将其释放至胞外。胞外的HSP60与细胞膜上的TLR-4受体结合，激活TLR-4信号通路，介导炎症因子的释放。本研究结果证实了以上推测，说明激活的小胶质细胞产生的HSP60可作为内源性配体进一步激活小胶质细胞导致自身的凋亡 。

目前对于神经退行性疾病治疗的研究工作有很大一部分是针对抑制小胶质细胞活化和细胞因子的分泌，因此寻找合适的药物至关重要。纳络酮是一种非选择性G蛋白偶联的阿片受体拮抗剂，因其具有抑制花生四烯酸代谢、阻止脂质过氧化、促进SOD生成、抑制Ca2+内流、提高Na-K-ATP酶活性等活性而被称为神经保护剂〔1〕。在帕金森病动物模型和大鼠神经元-胶质细胞共培养体系中都已证实纳络酮可抑制LPS激活的小胶质细胞产生TNF-α、IL-1β、NO和超氧自由基,减少多巴胺神经元的退行性病变，具有神经保护作用〔7，8〕。本实验中纳洛酮对rhHSP60激活的小胶质细胞的抑制作用,可能就是通过抑制小胶质细胞膜上TLR-4的表达，从而阻断HSP60与TLR-4的结合，进而抑制TLR-4信号通路炎性因子的释放而完成的,其具体机制还需进一步研究。

4参考文献

1孟庆林.盐酸纳洛酮在急诊和急性中毒的应用〔J〕.临床荟萃，1996;11(9)：399-420.

2Cheng WJ,Li YH,Hou XL,etal.HSP60 is involved in the neuroprotective effects of Naloxone〔J〕.Mol Med Report,2014;10(12):2172-6.

3Kim SC,Stice JP,Chen L,etal.Extracellular heat shock protein 60,cardiac myocytes,and apoptosis 〔J〕.Circ Res,2009;105(11):1186-95.

4Lin L,Kim SC,Wang Y,etal.HSP60 in heart failure:abnormal distribution and role in cardiac myocyte apoptosis 〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007;293:H2238.

5Gonzalez-Scarano F,Baltuch G.Microglia as mediators of inflammatory and degenerative diseases〔J〕.Annu Rev Neurosci,1999;22(2):219-40.

6Aloisi F.Immune function of microglia 〔J〕.Glia,2001;36(2):165-79.

7Liu B,Du L,Hong JS.Naloxone protects rat dopaminergic neurons against inflammatory damage through inhibition of microglia activation and superoxide generation 〔J〕.J Pharmacol Exp Ther,2000;293(6):607-17.

8Liu Y,Qin L,Wilson BC,etal.Inhibition by naloxone stereoisomers of β amyloid peptide(1～42)induced superoxide production in microglia and degeneration of cortical and mesencephalic neurons 〔J〕.J Pharmacol Exp Ther,2002;302(9):1212-9.

〔2015-01-17修回〕

(编辑徐杰)