缺血后处理对大鼠脑缺血再灌注后周细胞的影响

缺血后处理对大鼠脑缺血再灌注后周细胞的影响

韩冬孙淼张进1何平平张鸿冯娟

(中国医科大学附属盛京医院神经内科，辽宁沈阳110004)

摘要〔〕目的探讨缺血后处理对大鼠脑缺血再灌注后周细胞变化的影响。方法30只Wistar雄性大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组(I/R组)和缺血后处理组(IP组)。采用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血模型，脑缺血2 h后IP组给予缺血后处理。于脑缺血再灌注后24 h行TTC染色观察脑梗死体积测定，应用透射电镜观察周细胞结构的微观变化，行各组间比较。结果IP组脑梗死体积明显小于I/R组;I/R周细胞胞体肿胀，呈椭圆形，压迫微血管，管腔明显变小，IP组周细胞肿胀减轻，微血管管腔轻度狭窄；I/R组周细胞与基底膜部分分离，IP组周细胞贴敷于基底膜外周。结论缺血后处理可减小大鼠脑缺血再灌注后减小梗死体积，减轻因周细胞改变导致的管腔变小及抑制周细胞迁移，具有神经保护作用。

关键词〔〕缺血后处理；周细胞；神经血管单位；缺血/再灌注

中图分类号〔〕R743.3〔文献标识码〕A〔

基金项目：辽宁省博士科研启动

通讯作者：冯娟(1965-)，女，主任医师，博士生导师，主要从事脑血管疾病研究。

1吉林大学第一医院风湿科

第一作者：韩冬(1978-)，男，副教授，博士，主要从事脑血管疾病研究。

缺血性脑血管病是临床的常见病和多发病。脑缺血发生后，血脑屏障(BBB)遭到破坏，导致脑水肿、大分子物质进入脑组织、甚至发生出血转化。BBB由内皮细胞、基底膜、周细胞及星形胶质细胞终足组成。其中周细胞位于内皮细胞和基底膜外，包绕于微血管周围，分布广泛，在脑中周细胞与内皮细胞数量比例大约为1∶3。以前观点认为周细胞仅是支持细胞，但越来越多研究证实，周细胞还具有调节脑微循环血流〔1〕、维持血脑屏障稳定性〔2〕以及促进内皮细胞紧密连接形成〔3〕、吞噬和抗原呈递作用以及多能干细胞功能〔4〕等作用。脑缺血后处理〔5〕是指在缺血再灌注后一定时间内，给予1次或多次短暂性缺血再灌注，使脑组织对前面较长时间的缺血产生耐受。Zhao等〔6〕于2006年首先发现缺血后处理的神经保护作用，可以减小脑梗死体积，减轻神经功能损伤，抑制细胞凋亡。本实验采用线拴法制备大鼠局灶性脑缺血模型，电镜观察周细胞微观形态改变，探讨缺血后处理对缺血再灌注后周细胞变化的影响。

1材料与方法

1.1实验动物与分组雄性清洁级Wistar大鼠，体重250～280 g，由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。动物随机分为假手术组(Sham)组，缺血再灌注组(I/R)组和缺血后处理组(IP)组，每组10只动物。

1.2动物模型采用Longa法〔7〕制作大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型适当改良后进行。建立大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型。术中用电热毯及电烤灯保持大鼠肛温在36℃~37℃，术后分笼饲养。Sham组：栓线插入深度为10 mm，使栓线头端停留于颈内动脉内而不进入大脑中动脉内。I/R组：缺血120 min后，将大鼠再次麻醉，将栓线抽出，实现大脑中动脉血流再通。IP组：在缺血120 min后，拔出5 mm栓线，使血管再通30 s，然后再将栓线插入5 mm，阻断血流30 s，如此进行3个循环，进行缺血后处理。之后拔出栓线实现永久再灌注。所有大鼠于再灌注24 h处死取材。

1.3脑梗死体积测定TTC染色：脑切成2 mm厚，放于2%TTC染液中，37℃温育15 min。正常脑细胞染成橘红色，梗死区不着色，用图像处理软件(Acrobe，photoshop5.0)计算梗死面积(橘红色区域为正常脑组织，白色区域为梗死区)、各脑片梗死面积之和乘以厚度(2 mm)为总的梗死容积。梗死体积百分率=(正常侧大脑半球体积-梗死侧非梗死区脑组织体积)/正常侧大脑半球体积×100%。

1.4电镜切片的制备和观察大鼠脑缺血再灌注24 h后迅速断头取脑，取1×1×1 mm3大小的新鲜脑组织，放入2.5%戊二醛中浸泡固定，2%四氧化锇后固定，梯度酒精脱水，环氧树脂618包埋、超薄切片经醋酸铀、枸橼酸铅双重染色后，在80 kV条件下用JEM-1200EX型透射电镜观察结果。

1.5统计学方法采用SPSS13.0软件进行q检验及t检验。

2结果

2.1缺血后处理对大鼠梗死体积的影响TTC染色结果显示，Sham组未见梗死灶，见图1。I/R组和IP组右侧大脑半球可见白色脑梗死灶，I/R组和IP组梗死体积百分比分别为29.92%±5.57%和20.99%±4.66%，IP组梗死体积百分比明显小于I/R组(P<0.05)。

2.2缺血后处理对MCAO大鼠周细胞迁移的影响Sham组周细胞细胞核扁圆形，紧贴于基底膜外壁，基底膜规整； I/R组周细胞明显肿胀，细胞收缩呈椭圆形，导致微血管管径变小，管腔变窄，基底膜紊乱，紧密连接开放，周细胞与基底膜分离；而IP组周细胞肿胀较I/R组减轻，管腔轻度狭窄，紧密连接未开放，周细胞仍贴于基底膜外壁，见图2。

图1　脑缺血2 h再灌注24 h脑梗死大体观察

图2　缺血2 h再灌注24 h后周细胞变化(×10 000)

3讨论

目前神经血管单元是脑缺血再灌注后神经保护的热点。神经血管单元是由Lo等〔8〕于2003年提出的概念模型，它由神经元、BBB(包括星形胶质细胞足突，微血管内皮细胞，基底膜及周细胞等)、小胶质细胞及维持脑组织完整的细胞外基质组成，是神经系统结构和功能单位。神经血管单元重点在于强调整体，而不是单一某一细胞，其中各个成分之间存在密切关系，相互影响、相互依存。缺血后处理对于脑缺血再灌注损伤具有一定的神经保护作用〔9~11〕，可以减小脑梗死体积，减轻神经功能损伤，与本实验观察到的缺血后处理的神经保护作用相同。我们在以前的实验中证实了缺血后处理对缺血再灌注后的神经-血管单元具有一定保护作用〔12〕。

BBB是神经血管单元的核心结构，BBB中的任何一种成分受损都会影响到其他成分，所以周细胞的改变也直接影响BBB的其他成分及其功能。周细胞包绕于微血管外周，大量表达一种与血管平滑肌细胞相同的收缩蛋白——α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。在正常情况下，周细胞可通过这种蛋白的动态收缩和舒张控制微血管管腔大小变化来控制微血流的变化〔13〕。在脑缺血再灌注发生后，产生大量的活性氧自由基、细胞内钙超载〔14，15〕及氧化物——亚硝基〔16〕，这些物质可以刺激周细胞持续过度收缩α-SMA，进一步加重微循环障碍。Dalkara等〔17〕研究发现，在局灶性MCAO模型中，周细胞的收缩发生在大脑中动脉闭塞期间及血流恢复以后一段时间。本文电镜观察证实了脑缺血再灌注后周细胞形态改变，细胞收缩，导致微血管管径变小，进一步加重脑缺血。而缺血后处理能够抑制周细胞的这种收缩作用，从而减轻了周细胞对微血管的影响。

在体外内皮细胞、周细胞及星形胶质细胞混合培养的BBB模型中，在缺氧条件下，单层内皮细胞渗透性增加，而周细胞则可以减弱这种渗透性，说明周细胞有助于维持内皮细胞功能。而且，当内皮细胞与周细胞共同培养时，可以降低内皮细胞对缺氧的敏感性〔18〕。周细胞可以表达的TGF-β1和AP-1以及分泌的Ⅳ型胶原蛋白、层黏连蛋白、透明质酸有关，前者参与维持BBB的紧密连接，后者参与基底膜的形成〔3〕，所以周细胞对于BBB稳定性的维持有重要作用。Duz等〔19〕在大鼠MCAO模型中超微结构研究中发现，在缺血早期，周细胞从血管壁分离，微血管基底膜结构紊乱，而且周细胞与紧密连接关系密切，这种结构的改变可能导致BBB通透性增高，所以周细胞在缺血早期的迁移加重BBB功能损害，我们在电镜中也发现了脑缺血再灌注后周细胞与血管壁分离、紧密连接开放、基底膜紊乱的现象，而缺血后处理则能够减轻这种分离现象，同时抑制紧密连接开放及减轻基底膜紊乱，起到对BBB的保护作用。有实验证实了缺血后处理可以减轻缺血再灌注后BBB的通透性升高〔19，20〕，而缺血后处理对周细胞的保护可能是其对BBB起到保护作用的机制之一。

缺血后处理对周细胞的保护作用机制目前还不完全清楚。在体外研究中〔21〕发现周细胞能够释放MMP-9，MMP9可以刺激周细胞迁移，从而导致BBB受损。而MMP-9在脑缺血后表达明显增加〔22〕，缺血后处理可以减少MMP-9的表达〔23〕，从而抑制了周细胞在缺血再灌注后的迁移，保持BBB结构和功能的完整。总之，在脑缺血再灌注后，周细胞在BBB结构和功能改变中起到一定的作用，而缺血后处理能够减少缺血再灌注对周细胞的损伤，从而起到保护BBB的作用，但是周细胞在缺血再灌注后对BBB的作用机制以及缺血后处理对周细胞的保护机制，还有待进一步研究。周细胞为脑缺血后神经保护提供了新的靶点，同时为临床治疗脑梗死提供新的思路。

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〔2014-01-05修回〕

(编辑曹梦园)