决明子对便秘小鼠结肠肌电和水通道蛋白3表达的影响

决明子对便秘小鼠结肠肌电和水通道蛋白3表达的影响

刘旭杜爱林1姜洪波2陈亚云1张小艳1杨社敏1张瑞岭1刘晓丽1

(新乡医学院三全学院，河南新乡453003)

摘要〔〕目的探讨决明子对慢传输型便秘小鼠结肠肌电活动和水通道蛋白3(AQP3)在结肠黏膜表达的影响。方法40只雄性小鼠随机分为四组，对照组、便秘组、决明子组和酚酞组(阳性对照组)。建立小鼠慢传输便秘模型，用决明子，酚酞灌胃治疗决明子组和酚酞组。检测4组小鼠首便时间，6 h排便数量，结肠肌电信号，结肠黏膜AQP3的表达。结果决明子组与便秘组相比，首便时间缩短，6 h粪便数量增加(P<0.05)，结肠肌电慢波频率振幅均有极显著差异(P<0.01)，频率变异系数有显著差异(P<0.05)，结肠黏膜AQP3平均光密度有极显著差异(P<0.01)。结论决明子能够有效地改善小鼠结肠运动功能，减少结肠黏膜AQP3的表达，对慢传输型便秘治疗具有显著疗效。

关键词〔〕便秘；结肠；肌电；水通道蛋白3

中图分类号〔〕R337.4〔文献标识码〕A〔

项目基金

通讯作者：刘晓丽(1968-)，女，高级实验师，主要从事结肠肌电生理研究。

1新乡医学院2新乡医学院第三附属医院

第一作者：刘旭(1990-)，女，本科在读，主要从事临床医学研究。

Effects of Semen Cassiae on colonic myoelectrical activity and AQP3 in mice

LIU Xu，DU Ai-Lin，JIANG Hong-Bo,etal.

Sanquan College of Xinxiang Medical University， Xinxiang 453003,Henan,China

Abstract【】ObjectiveTo study Semen Cassiae on the colonic myoelectrical activity and the effect of the expression of aquaporin-3(AQP3) in the colonic mucosa of mice with slow transit constipation.Methods40 male mice were randomly divided into:control,constipation,Semen Cassiae and phenolphthalein groups(positive control group).The compound diphenoxylate tablets for intragastric mice was used to establish mice model of slow transit constipation,and then the Semen Cassiae,and phenolphthalein were given by intragastric administration to treat the mice of Semen Cassiae group and phenolphthalein group,respectively.The constipation group were orally administered with the same volume of distilled water.The bowel transit function was measured by eosin propulsion test and the first defecation time and the number of red stool in the initiative 6 hours were recorded.BL-420F system was used for collecting change of myoelectrical signals of the mice colon.Immunohistochemical was used to detect the expression of AQP3 in colon mucosa of mice.ResultsThe effect of Semen Cassiae on the first defecation time and the number defecation of red stool in the initiative 6 hours had obviously changed.The grain number of red stool in 6 hours of constipation group was less than that of control group,associated with prolong of the first defecation time (P<0.01).Compared with constipation group,Semen Cassiae group and phenolphthalein group shortened the first defecation time and increased the grain number of the defecation red stool in 6 hours of the mice (P<0.05).The constipation group of colonic myoelectrical activity of mice slow-waves frequency was (7.78±1.59) Hz,slow-waves amplitude was (0.06±0.01) mV,and the Semen Cassiae group of slow-waves frequency was (3.32±0.55)Hz,slow-waves amplitude was (0.07±0.02) mV.Compared with the constipation group,there were all significant differences (P<0.01).Compared with the Semen Cassiae group 〔(12.49±0.99)%〕,c slow-waves frequency variation coefficient of constipation group was significantly increased 〔(21.09±2.40)%,P<0.01〕.There was no significant difference in the slow-waves amplitude variation coefficient between constipation and Semen Cassiae groups(16.91%±8.45%,vs 15.75%±4.09%,P>0.05).There was significant difference in the expression of the mean optic density of AQP3 in colonic mucosa between constipation and Semen Cassiae groups(0.23±0.02 and 0.15±0.01,P<0.01).ConclusionsSemen Cassiae could improve motor function in mice colon,reduce expression of AQP3 in colon mucosa,and has significant effects on the treatment of slow transit constipation.

【Key words】Constipation;Colon;Myoelectrical;AQP3

便秘会因体内有害物质不能及时排除，从而引起腹胀、嗳气、胃酸、中毒的反应，导致肠道生态平衡失调，增加大肠癌发生的危险〔1〕。慢性便秘还可诱发老年痴呆症、心脑血管疾病、脑血管意外、心肌梗死等严重疾病。同时，便秘还是多种疾病的并发症。目前临床常用来治疗便秘的药物多具有依赖性，副作用明显，刺激性大。而决明子作为一种药食同源品种，具有刺激性小，服用方便，价格便宜等优点。目前普遍认为蒽醌类是决明子起泻下作用的主要成分，但对决明子治疗慢传输型便秘的作用机制尚未完全清楚，因此，本研究利用结肠肌电和免疫组织化学技术，探讨慢传输型便秘小鼠结肠肌电活动和结肠黏膜AQP3表达的影响。

1材料与方法

1.1动物48只雄性昆明小鼠，体质量为20~25 g，由新乡医学院实验动物中心提供。按体重随机分为4组，对照组、便秘组、酚酞组、决明子组，每组6只。

1.2主要试剂复方地芬诺酯片(河南鼎昌药业有限公司，批号：12060701)，酚酞片(山西亨瑞达制药有限公司，批号：130106)，曙红Y来源于上海永绿生物有限公司(CAS 号:17372-87-1)，决明子(新乡市同仁堂药房提供)，一抗兔抗鼠单抗AQP3，(北京博奥森生物有限公司，Lot:980590W)，兔SP检测试剂盒(北京中杉金桥有限公司，批号：13152A04)，磷酸盐缓冲液(PBS 0.01 mol/L，pH7.2~7.4)，DAB显色试剂盒ZLI-9018(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：K1352222E)等。

1.3主要仪器BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)，自制铜丝电极直径0.5 mm，长度4 mm。

1.4造模每天中午12时，除对照组外，其余三组小鼠均灌胃复方地芬诺酯片25 mg/kg〔2〕，对照组灌胃等体积蒸馏水。决明子组和酚酞组每天下午18：00，分别灌胃决明子3 g/kg(按小鼠用药量是成人9倍计算，决明子研磨成粉沸水冲泡冷却至室温时灌胃〔3〕)，酚酞30 mg/kg，其他组灌胃等体积蒸馏水，除对照组外，其他组均限水。连续造模1 w。1 w后，四组小鼠均按照10 mg/kg灌胃曙红悬浊液，然后观察并记录小鼠首便时间和最初6h红便数量。

1.5结肠肌电测定用BL-420F生物机能实验系统进行肌电测定，具体方法参照卢智敏等〔4〕描述，灵敏度选择:增益2 mV，时间常数3 s，高频滤波为10 Hz，连续记录1 h左右。将每组的记录结果5 min作为一个时间段，分别计算出每一时间段的频率和振幅的均值、标准差及变异系数，再取各组均值、标准差及变异系数进行比较。慢波频率变异系数(%)=慢波频率标准差/慢波频率均值×100%。慢波振幅变异系数(%)=慢波振幅标准差/慢波振幅均值×100%。

1.6免疫组织化学技术造模完成后，四组小鼠禁食24 h，20%乌拉坦腹腔注射麻醉(5 mg/kg)，取小鼠结肠近段进行常规固定，脱水，石蜡包埋，切片，切片厚度7 μm。常规免疫组织化学技术染色(其中二抗浓度为1∶150)每次试验以酚酞组作为阳性对照，用PBS代替一抗做阴性对照，光学显微镜下观察AQP3的表达情况，以细胞中出现明显的棕褐色颗粒为阳性细胞，在400倍光镜下选择5个完整不重叠视野，用Image pro-Plus6.0软件分析每个视野平均光密度值。

1.7统计学方法采用SPSS11.0进行t检验。

2结果

2.1粪便性质的改变便秘组、决明子组和酚酞组小鼠粪便比对照组粒小、干燥、质硬。便秘组与对照组相比，首粒红便时间显著延长(P<0.01),便秘组6 h红便粒数少于对照组(P<0.01)。决明子组与便秘组相比首粒红便时间缩短(P<0.05)，便秘组6 h红便粒数与决明子组相比，决明子组6 h红便粒数显著增加(P<0.05)。酚酞组首粒粪便时间与便秘组相比显著缩短(P<0.05)，便秘组6 h红便粒数与酚酞组相比显著减少(P<0.05)。见表1。

2.2结肠黏膜AQP3表达情况AQP3阳性表达为棕褐色颗粒，结肠黏膜AQP3主要分布在吸收细胞和杯状细胞基底侧细胞膜及靠近基底部的细胞质和细胞顶部。对照组AQP3主要表达于吸收细胞，杯状细胞表达较少。便秘组吸收细胞和杯状细胞几乎都有AQP3表达，染色较深。决明子组、酚酞组与便秘组相比AQP3表达主要以吸收细胞为主，表达较少。对照组AQP3表达的平均光密度值为0.147±0.014，便秘组为0.235±0.023，便秘组AQP3表达强度明显高于对照组(P<0.01)，决明子组AQP3表达的平均光密度值为0.153±0.014，便秘组明显高于决明子组(P<0.01)，酚酞组AQP3表达的平均光密度值为0.179±0.010，便秘组明显高于酚酞组(P<0.01)。见图1。

表1　四组小鼠排便情况比较

与便秘组比较：1)P<0.01,2)P<0.05，下表同

图1　四组小鼠结肠上皮细胞AQP3的免疫组化 染色表达(DAB，×400)

2.3 结肠肌电活动四组小鼠的结肠慢波表现近似于正弦波样曲线。对照组慢波频率、振幅规律。便秘组慢波波形不规则，慢波频率、振幅较不规律。决明子组和酚酞组慢波表现有不明显双峰，慢波频率、振幅较规律。见图2。与对照组比较，便秘组慢波频率加快(P<0.01)，慢波振幅减小(P<0.01)。与对照组比较，便秘组慢波频率变异系数较大(P<0.01)，两组慢波振幅变异系数比较无显著差异(P>0.05)。与决明子组相比，便秘组慢波频率加快(P<0.01)，慢波振幅减小(P<0.01)。

图2　四组小鼠的慢波波形

与决明子组相比，便秘组慢波频率变异系数较大(P<0.05)，两组慢波振幅变异系数比较，无显著差异(P>0.05)。与酚酞组比较，便秘组慢波频率加快(P<0.01)，慢波振幅减小(P<0.01)。与酚酞组比较，便秘组慢波频率变异系数比较(P<0.05)。两组慢波振幅变异系数比较减慢，无显著差异(P>0.05)。见表2。

表2　四组小鼠的慢波频率和振幅比较 ± s, n=6)

3讨论

传统中医学认为决明子性味甘苦，咸微寒，入肝经、大肠经。主要功效为清肝、明目、润肠通便。决明子在治疗便秘方面效果显著，后遗症低、并发症低、不良反应小，常应用在便秘的临床治疗中〔5〕。经现代医学研究证明决明子在降压、降脂、保肝、抗氧化等方面也有一定疗效〔6〕，拥有诸多优点，应被广泛推广使用。

慢波是相对规律的一种周期性电活动，控制着肠道收缩节律，无论收缩与否始终存在〔7〕。结肠肌电动作电位产生于慢波之上，与平滑肌收缩一致，是结肠推进性运动的主要动力，所以，结肠慢波的频率和振幅也就可以作为反映结肠功能的一项客观电生理指标〔8〕。本实验表明决明子在一定程度上可以恢复慢传输型便秘小鼠慢波频率、振幅，减小频率变异系数，提示恢复慢传输型便秘小鼠结肠慢波的频率和振幅是决明子治疗慢传输型便秘的机制之一。

AQPs广泛存在于人体的各个器官组织细胞中，是一种可使水通过浆膜的膜蛋白家族，AQP3是水通道蛋白家族中的一个亚型，AQP3主要在结肠表达〔9〕，在结肠内容物水的调节中发挥重要作用，抑制结肠内AQP3的功能将导致腹泻〔10〕。结肠黏膜AQP3主要分布在细胞基底侧及腔面细胞质〔11〕，其主要功能是将肠腔内的水从基底侧转移到细胞间隙中。因此，结肠黏膜内AQP3表达强度和功能与结肠内水分的多少有关，从而对便秘的形成，具有一定影响。本实验结果说明便秘小鼠经决明子治疗后AQP3表达强度减弱。由此，可能提示决明子治疗慢传输型便秘的机制之一是通过下调结肠黏膜AQP3的表达，增加肠道水分，起到润滑肠道内容物的作用。

肠道神经系统主要的抑制性递质是血管活性肠多肽(VIP)。VIP是广泛存在的脑肠肽，在消化系统中十二指肠和结肠含量最高〔12〕，能松弛肠道平滑肌，对胃肠运动起抑制性调节作用。有研究指出，蔥醌类物质能显著提高糖尿病大鼠血浆的VIP水平，从而使糖尿病所致的胃肠推进功能减退〔13〕。本实验中决明子可能通过其蒽醌类物质作用于VIP，增加结肠推进功能，缓解便秘，而其推进功能的提高可能经慢波频率和振幅的显著增加的形式来表现。Itoh等〔14〕研究发现VIP通过cAMP依赖的途径上调AQP3 mRNA和蛋白表达，推测VIP参与便秘发生与上调AQP3的表达。本实验中决明子组AQP3的表达减少提示决明子可能通过调节结肠VIP的含量，下调AQP3的表达，减少结肠内水分的吸收，减轻肠壁水肿，提高肠黏膜敏感性，增大的肠道内容物体积，刺激肠黏膜，增加肠道蠕动，而缓解小鼠慢传输型便秘。

4参考文献

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〔2014-07-09修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)