VEGF、MMP－2和TNF－α在子宫肌瘤组织中的表达及临床意义

VEGF、MMP-2和TNF-α在子宫肌瘤组织中的表达及临床意义

张冬红牛建清1杨素梅

(唐山市开滦(集团)有限责任公司唐家庄医院，河北唐山063100)

摘要〔〕目的检测血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP)-2和肿瘤坏死因子 (TNF)-α在人子宫肌瘤中的表达，探讨其在子宫肌瘤发生、发展的作用。方法取2013年1～12月该院收治的54例子宫肌瘤患者的子宫肌瘤组织和正常子宫肌组织，分别采用免疫组化法测定雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的表达，采用RT-PCR法测定VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA的表达，比较子宫肌瘤组织和正常子宫肌组织表达的差异，并且分析ER、PR与VEGF、MMP-2、TNF-α 表达的相关性。结果(1)子宫肌瘤组织ER和PR的阳性表达率分别为68.52%和75.93%，均显著高于正常子宫肌组织(P<0.05或P<0.01)；(2)子宫肌瘤组织中VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA表达水平均较正常子宫肌组织显著升高(P<0.01)；(3)ER(+)和PR(+)子宫肌瘤组织VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA表达较ER(-)和PR(-)子宫肌瘤组织均显著升高(P<0.01)；(4)相关性分析显示，ER、PR表达评分均与VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA表达水平呈正相关(P<0.01)。结论VEGF、MMP-2和TNF-α在子宫肌瘤均高表达，在其发生、发展中起重要作用，并且ER和PR的高表达相关。

关键词〔〕子宫肌瘤；肿瘤坏死因子-α；基质金属蛋白酶-2；血管内皮生长因子

中图分类号〔〕R73〔文献标识码〕A〔

基金项目：河北省科学技术厅课题(20132924)

1开滦总医院

第一作者：张冬红(1979-)，女，主治医师，主要从事妇产科疾病研究。

子宫肌瘤多数患者进展缓慢，少数可发生变性、坏死，或发展为恶性肿瘤〔1〕。现代医学认为其为激素依赖性肿瘤，组织局部雌激素合成和代谢异常导致雌激素堆积是雌激素依赖性疾病发生发展的重要原因〔2〕。随着对子宫肌瘤研究的不断深入，血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMPs)和肿瘤坏死因子(TNF)-α也可能参与子宫肌瘤的形成。本实验探讨VEGF、MMP-2和TNF-α 在子宫肌瘤发生、发展中的作用以及与雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的相互作用。

1材料与方法

1.1标本来源2013年1～12月本院收治的子宫肌瘤患者54例纳入本次研究。年龄50～78岁，平均(67.43±8.75)岁，均出现月经量增多，经期延长，下腹部硬块或下腹部疼痛、压迫等症状及体征。纳入标准：(1)年龄>50岁；(2)绝经1年或以上；(3)病理学确诊为子宫肌瘤；(4)接受子宫肌瘤切除术。排除标准：(1)术前近3个月服用激素类药物；(2)严重心脏、肝脏、肾脏疾病患者。本研究得到医院伦理委员会的批准，并且所有患者均知情同意。子宫肌瘤组织标本取自子宫肌瘤中心与肌瘤边缘连线中间处，子宫肌组织取自子宫肌瘤旁1 cm以外，各组织样本分别以0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小置于Enpendof管中，部分放入液氮罐保存，另外组织样本置于10%中性甲醛溶液中固定24 h，常规石蜡包埋。

1.2主要试剂ER和PR抗体均由英国Abcam公司提供；HRP标记的山羊抗兔IgG和HRP标记的山羊抗鼠IgG、浓缩型DAB 试剂盒、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液(PBS)，购自北京中杉公司；RNA提取试剂，美国Invitrogen公司提供；BCA试剂盒，美国IMerce公司提供；反转录试剂盒，美国Promega公司提供。VEGF、TNF-α、MMP-2和内参β-actin引物均由上海鼎安生科科技有限公司合成。引物：VEGF：正义：5'-TGCAGATTATGCGGATCAAA CC-3'、反义：5'-TGCATTCACATTTGTTGTGCTGTAG-3'，产物长度81 bp；TNF-α正义：5'-CAGCCTCTTCTCCTTCCTGA-3'、反义：5'-GGAAGACCCCTCCCAGATAGA-3'，产物长度367 bp；MMP-2正义：5'-CGCTCAGATCCGTGGTGAGAT-3'、反义：5'-CGGGAGCTCAGGCCAGAATG-3'，218 bp；β-actin正义：5'-ACCAACTGGGACGACATGGACAAA-3'、反义：5'-ACTCCTGCT TGCTGATCCACATCT-3'，产物长度187 bp。

1.3免疫组化法测定ER和PR的表达常规石蜡包埋切片3～4 μm，石蜡切片用二甲苯脱蜡至去离子化，乙二胺四乙酸修复缓冲液进行抗原高压热修复，打孔剂洗涤后采用3%过氧化氢室温孵育10 min，PBS洗涤后分别滴加一抗，4℃孵育过夜，PBS 洗涤加入二抗37℃孵育30 min，PBS 洗涤，DAB显色，冲洗，苏木素复染，脱水、透明、封片。ER或PR阳性判断采用Sinicrope 改良法：根据切片中染色细胞计数和染色强度进行评分，表达评分= 染色细胞计数评分× 染色强度评分，表达评分<1 分为阴性结果，2～3 分为弱阳性，4～5 分为中度阳性，>5 分为强阳性。

1.4PT-PCR法测定VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA的表达取0.1 g 组织加入1 ml Trizol 试剂按照说明书提取试剂盒制备总RNA。取RNA样品，用核酸分析仪进行定量，测定260 nm和280 nm的吸光度(A)值，控制A260/A280在1.9～2.1。用2%琼脂糖凝胶电泳确定RNA 质量，立即用于cDNA 合成。PCR反应体系共25 μl：ddH2O 16.25 μl，10×PCR-Buffer 2.5 μl，10 mmol/L dNTP 2.5 μl，Taq酶0.5 μl，上下游引物各0.5 μl，SYBR GreenI 0.25 μl，cDNA 2 μl。RT-PCR按照SYBR Green PCR Reagents说明书应用7500 Real Time PCR System进行扩增。RT-PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离检测，结果用凝胶自动成像2000系统扫描，使用基于内参物β-actin的相对定量分析，目的基因mRNA表达量用2-⊿⊿Ct计算。

1.5统计学方法采用SPSS12.0软件，计量资料组间比较采用t检验；计数资料采用χ2检验；采用Pearson 相关性分析。

2结果

2.1子宫肌瘤和正常子宫肌组织ER和PR蛋白表达阳性率的比较子宫肌瘤组织ER阳性率为68.52%；PR阳性率为75.93%，正常子宫肌组织ER阳性率44.44%，PR阳性率为40.74%，子宫肌瘤组织均显著高于正常子宫肌组织(χ2=6.366，P=0.012，χ2=13.752，P=0.000)。见表1。

表1　子宫肌瘤和正常子宫肌组织ER和PR蛋白阳性率表达的比较〔 n(%), n=54〕

2.2子宫肌瘤和正常子宫肌组织VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA表达水平比较子宫肌瘤组织中VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA表达水平均较正常子宫肌组织显著升高(P<0.01)。见表2。

表2　子宫肌瘤和正常子宫肌组织VEGF、MMP-2和

2.3ER(+)和ER(-)子宫肌瘤组织VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA表达的比较ER(+)子宫肌瘤组织VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA表达较ER(-)子宫肌瘤组织显著升高(P<0.01)。见表3。

表3　ER(+)和ER(-)子宫肌瘤组织VEGF、

2.4PR(+)和PR(-)子宫肌瘤组织VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA表达的比较PR(+)子宫肌瘤组织VEGF、MMP-2和TNF-α mRNA表达较PR(-)子宫肌瘤组织显著升高(P<0.01)。见表4。

表4　PR(+)和PR(-)子宫肌瘤组织VEGF、

2.5子宫肌瘤组织ER、PR表达评分与VEGF、MMP-2、TNF-α mRNA表达水平的相关性分析ER、PR表达评分均与VEGF(r=0.427、0.512)、MMP-2(r=0.573、0.589)和TNF-α mRNA(0.627、0.652)表达水平呈正相关(均P<0.01)。

3讨论

子宫肌瘤又称子宫平滑肌瘤，子宫肌瘤是女性生殖器官中最常见的良性肿瘤，是影响妇女生殖健康的常见病及多发病，并且是导致不孕、月经失调及子宫切除的主要原因。据报道，育龄妇女中其发病率高达25%～40% ，年龄>40 岁的妇女约有50% 患有子宫肌瘤〔3〕。该疾病发病初期多无显著临床症状，随病情发展可表现出月经过多、下腹部包块或排尿、排便困难等临床表现〔4〕。子宫肌瘤虽然绝大多数子宫肌瘤呈现良性，但也有少数产生恶变。

子宫肌瘤的发生、发展是多步骤、多因素的复杂过程，其病因尚未十分明确，目前的资料表明子宫肌瘤是甾体激素依赖性肿瘤，子宫肌瘤的生长依赖于卵巢固醇类雌孕激素，与基因、细胞增殖与凋亡、细胞信号传导途径异常及细胞因子等多种因素有关〔5〕。近来研究表明孕激素对子宫肌瘤更有促生长作用〔6〕。雌激素、孕激素分别通过ER、PR 发挥生物学作用。ER、PR 与雌、孕激素有较高的亲和力，选择性保留较高浓度的雌、孕激素，从而使其生物学效应加强〔7〕。本研究结果再次说明ER和PR在子宫肌瘤发展中发挥作用。

VEGF是一种糖基化多肽性分泌因子，是由两个相同亚基以二硫键交联结合而成、具有高度保守性的同源二聚体糖蛋白〔8〕。VEGF为目前发现的最强的内皮细胞有丝分裂原，增加血管通透性，促进内皮细胞有丝分裂，直接刺激血管生成，是刺激肿瘤血管发生、血管重塑、血管芽生的关键调节因子〔9〕。本研究结果说明VEGF在子宫肌瘤组织中呈高表达。雌激素和孕激素通过VEGF受体介导能调节多种与细胞增殖相关的基因表达，参与子宫肌瘤内皮增生及血管生成的局部因子以VEGF表达最强，VEGF还可增加血管通透性，为血管形成过程中多种细胞迁移提供纤维网络，促进肌瘤生长。VEGF mRNA表达与ER和PR高表达相关。

随着对子宫肌瘤研究的不断深入，发现MMPs 家族促进血管基底膜的降解，导致的结果包括血管通透性增加、血管壁完整性受损，导致下游VEGF 释放增加，参与子宫平滑肌瘤的发病过程。MMP-2是一种非糖化、分子量为72 kD的明胶酶，由许多结缔组织细胞分泌，主要降解I、Ⅱ、Ⅲ型明胶，以及Ⅳ、V、Ⅶ、X型胶原与纤粘连蛋白、弹性蛋白〔10〕。所有靠大量ECM重构的过程都可能涉及MMP-2，从而破坏细胞周围的ECM框架，进而影响到细胞与细胞、细胞与基质间的相互作用，促进细胞的分化和增生〔11〕。另一方面，MMP-2还激活其他MMPs，使蛋白溶解原酶转变成酶，参与细胞外基质的降解，使子宫平滑肌肿瘤得以进一步生长。本研究结果说明MMP-2在子宫肌瘤组织中呈高表达，MMP-2 mRNA表达与ER和PR高表达相关。

近年来TNF-α作为炎症反应的细胞因子倍受重视，被活化的吞噬细胞可释放大量TNF-α，使局部平滑肌组织细胞损伤及增生病变加剧，形成正反馈炎症病理损伤效应。此外，TNF-α可通过调节VEGF 的表达间接发挥血管形成作用,以及诱导细胞产生MMPs，从而参与疾病的发生〔12〕。已有研究〔13〕显示，TNF-α在肌瘤中表达高于邻近肌层，可能与炎症产物刺激单核吞噬细胞分泌TNF-α以及肌瘤细胞自分泌TNF-α有关。本研究结果说明TNF-α在子宫肌瘤组织中呈高表达，与上述研究一致。此外，TNF-α mRNA表达与ER和PR高表达相关。

总之，VEGF、MMP-2和TNF-α在子宫肌瘤均高表达，在其发生、发展中起重要作用，并且ER和PR的高表达相关。

4参考文献

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13Tvagi A，Agarwal C，Dwyer-Nield L，etal.Silibinin modulates TNF-alpha and IFN-gamma mediated signaling to regulate COX2 and iNOS expression in tumorigenic mouse lung epithelial LM2 cells〔J〕.Mol Carcinog，2012;51(10)：832-42.

〔2014-03-15修回〕

(编辑徐杰)