肝康乐对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用

肝康乐对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用

李凤袁静王玉凤

(安徽中医药大学中医临床学院，安徽合肥230038)

摘要〔〕目的探讨中药复方肝康乐对免疫抑制小鼠免疫功能的调节作用。方法通过给小鼠腹腔注射免疫抑制剂环磷酰胺复制免疫功能低下的动物模型，然后灌胃给予肝康乐高、中、低剂量，1次/d，连续10 d，分别测定小鼠的脾指数、胸腺指数，巨噬细胞的吞噬功能以及溶血素水平；二硝基氯苯诱导迟发型变态反应(DTH)，观察肝康乐对DTH的影响。结果肝康乐能够显著提高免疫低下小鼠的碳粒廓清率、脾指数、胸腺指数和血清溶血素水平，增强免疫低下小鼠的DTH。结论肝康乐煎剂可以增强免疫低下小鼠的免疫功能。

关键词〔〕肝康乐；特异性免疫；非特异性免疫

中图分类号〔〕R575〔文献标识码〕A〔

基金项目：安徽省教育厅自然科学基金(No.2006KJ096C)；安徽中医学院校自然科学基金(No.2012qn009)

第一作者：李凤(1978-)，女，硕士，讲师，主要从事中药复方药理与临床研究。

肝康乐是根据临床经验结合现代药理研究成果创立的方剂，该方精选了黄芪、党参、丹参、鳖甲、赤芍、柴胡、甘草等中药，用来治疗多种慢性肝脏疾病及肝纤维化。经临床实践证实，其对多种慢性肝脏疾病的防治具有较好疗效。我们前期实验曾以复方鳖甲软肝片作为对照，结果证实肝康乐对免疫损伤性肝纤维化有一定的防治作用〔1〕。本文探讨肝康乐对免疫低下小鼠的免疫调节作用。

1材料与方法

1.1动物昆明种小鼠(清洁级)，雌雄兼用，体质量18~22 g，由安徽医科大学实验动物中心提供，动物合格证号:皖医实动字第009号。豚鼠：购于安徽医科大学实验动物中心。

1.2药物肝康乐复方中各饮片由安徽中医药大学国医堂门诊部提供，经安徽中医药大学中药教研室教师鉴定。诸药水煎煮，3次水煎液混合后浓缩至1、2 g/ml，加苯甲酸钠防腐，冰箱保存备用。

1.3试剂和仪器环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号20091002)，印度墨汁(上海长江日用黏合材料厂)，绵羊红细胞(安徽中医学院第一附属医院检验中心提供)。2,4二硝基氯苯(上海试剂一厂生产),UV757CRT紫外分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。4000B型冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.4对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响(碳粒廓清法)〔2，3〕：取小鼠50只，随机分为五组，分别为正常组、模型组、肝康乐大、中、小剂量组，每组10只。正常组及模型组给予生理盐水(20 ml/kg)灌胃，肝康乐大、中、小剂量组(49.14，24.57，12.28 g/kg)分别以20 ml/kg不同浓度灌胃，每天1次，连续10 d；从第5天起，除正常组外，每鼠每天腹腔注射环磷酰胺50 mg/kg，每天1次，连续3 d；第10天，末次给药30 min后，每只小鼠尾静脉注射按1∶4稀释的印度墨汁(0.1 ml/10 g)，注射印度墨汁后2、10 min分别从眼眶后静脉丛取血于玻片上，用微量移液器汲取20 μl血液，吹打入2 ml0.1%Na2CO3溶液，以正常小鼠血加入2 ml 0.1%Na2CO3溶液为空白对照；紫外分光分光光度计650 nm处比色，测定光密度(OD)。小鼠脱颈椎处死，称取体重、肝、脾质量。分别代入以下公式计算碳粒廓清指数k和吞噬指数α。

1.5免疫器官重量的测定小鼠分组、复制模型及给药同1.4，末次给药30 min后，脱颈椎处死小鼠，称取体重和肝、脾重量，以每小鼠脾重(mg)/体重(g)和胸腺重(mg)/体重(g)作为脾脏和胸腺指数。

1.6小鼠血清溶血素生成的测定〔3〕小鼠按1.4分组，复制模型及给药，从第4天起，每只小鼠腹腔注射绵羊红细胞悬液0.2 ml致敏，致敏6 d后，即第10天，眼眶后静脉丛取血，放血的试管置4℃冰箱过夜，离心，收集血清作800倍稀释后，吸取0.5 ml稀释的血清放入另一试管中，依次加入10%SRBC、补体(豚鼠血清)、生理盐水各0.5 ml，空白管用生理盐水代替血清，混匀，置37℃水浴30 min后，离心，取上清液，分光光度计540 nm处比色，测OD值；代入以下公式计算血清溶血素含量，HC50=样本稀释血清的OD值×稀释倍数。

1.7对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响小鼠按1.4分组，复制模型及给药，给药10 d。参考文献〔4〕复制DTH模型，实验第2天用8%的氟化钠给小鼠腹部脱毛(3 cm×3 cm)，第3天每只小鼠腹部涂抹1%的二硝基氯苯(DNCB)丙酮麻油(丙酮∶麻油=1∶1)溶液20 μl，第6天，同法再次致敏一次，第9天每只小鼠右耳涂抹新鲜配制的1%的DNCB丙酮麻油溶液20 μl进行攻击，24 h后，沿耳廓基线剪下两耳，用直径8 mm打孔器打下圆耳片，称重，左右耳片之差为肿胀度。

1.8统计学处理采用SPSS11.0软件进行SNK方法。

2结果

2.1肝康乐对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响与正常组比较，模型组小鼠的碳粒廓清指数k值和吞噬指数α值明显降低(P<0.01)，提示环磷酰胺已引起小鼠免疫力低下；肝康乐大、中、小剂量组小鼠的α、k值均较模型组显著升高(P均<0.05)，但与正常组比较仍然偏低(P<0.01)，表明肝康乐均能提高免疫低下小鼠的免疫功能，但不能使之恢复至正常。见表1。

表1　肝康乐对免疫低下小鼠巨噬细胞

与正常组比较：1)P<0.05,2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.05,4)P<0.01，下表同

2.2肝康乐对免疫低下小鼠免疫器官重量的影响模型组小鼠的脾脏和胸腺指数较正常组明显降低(P<0.01)，肝康乐各剂量组脾脏及胸腺指数较模型组显著升高(P<0.05)，脾脏指数接近正常组(P>0.05)，表明肝康乐可显著提高免疫低下小鼠的脾脏和胸腺指数，其中，对脾脏的减重恢复较快。 见表2。

表2　肝康乐对免疫低下小鼠免疫器官重量的影响 ± s, n=10)

2.3肝康乐对免疫低下小鼠血清溶血素水平的影响模型组与正常组比较，小鼠血清HC50明显降低(

表3　肝康乐对免疫低下小鼠血清溶

2.4肝康乐对免疫低下小鼠DTH的影响在DNCB所致的DTH中,模型组小鼠耳肿胀程度较正常组明显减轻(P<0.01)，肝康乐三个剂量组都能不同程度地增加DNCB致敏后的小鼠耳廓肿胀度(P<0.05),增强免疫低下小鼠的DTH。见表3。

3讨论

机体免疫系统是一个复杂、平衡、有机的统一整体，具有严密的调控机制。免疫防御、自稳和监视功能构成了机体抵抗外来病原侵袭和维持内环境稳定的重要机制〔5〕。现代医学对机体免疫功能进行评价主要通过观察对机体非特异性免疫功能和特异性免疫功能的影响，其中对特异性免疫功能的影响又包括对细胞免疫和体液免疫的影响。当病原体侵入人体时，病原体首先被巨噬细胞与NK细胞识别、杀伤，巨噬细胞释放细胞因子，引起炎症反应。巨噬细胞与NK细胞在执行功能时，无严格的选择性，因此它们介导的免疫反应被称为非特异性免疫。Kupffer细胞是肝脏的巨噬细胞〔6〕。本研究以环磷酰胺诱导免疫低下模型，观察肝康乐对免疫功能的影响，结果发现：肝康乐各剂量组可明显提高免疫低下小鼠的碳粒廓清指数k值和吞噬指数α值，大剂量可使k值恢复接近正常组，但不能使α值恢复到正常范围内。各剂量组可使免疫低下小鼠胸腺及脾脏指数显著升高，可使脾脏指数恢复接近正常，使机体的细胞免疫和体液免疫功能受到保护；并且可显著提高免疫低下小鼠血清溶血素水平，使其恢复接近正常水平，提示肝康乐可提高免疫低下小鼠体液免疫功能。DTH是由T细胞介导的免疫应答的一种类型， T淋巴细胞介导的DTH的强弱是反映机体细胞免疫功能的敏感指标之一。肝康乐各剂量组均能够增强DNCB诱导的迟发型超敏反应,肝康乐具有增强细胞免疫的能力。肝康乐能增强免疫低下机体的免疫功能，使机体抗病能力有所增强，这一作用可能也是肝康乐能够防治慢性肝脏疾病和肝纤维化的机制之一。由于中药复方作用的多层次、多靶点、复杂性和不稳定性，其具体作用环节及详尽机制有待进一步研究。

4参考文献

1李凤，胡昊，凤良元，等.肝康乐抗免疫损伤性肝纤维化的实验研究〔J〕.安徽医药，2009;13(1)：21-2.

2杨海燕，张黎莉.至生胶囊对小鼠免疫功能的影响及其升白作用和抗应激能力的研究〔J〕.中成药，2010;32(2)：293-5.

3李仪奎，王钦茂.中药药理实验方法学〔M〕.上海：上海科学技术出版社，1991：157-8.

4徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学〔M〕.第3版.北京：人民卫生出版社，2002:1433-8.

5Guardia T,Rotelli AE,Juarez AO,etal. Anti-inflammatory properties of plant flavonoids. Effects of rutin,quercetin and hesperidin on adjuvant arthritis in rat〔J〕.Farmaco,2001;56(9):683-7.

6陈慰峰.医学免疫学〔M〕.第3版.北京：人民卫生出版社，2002:21-40.

〔2014-06-25修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)