丁苯酞对慢性酒精中毒大鼠海马内硫化氢和纤维状肌动蛋白的影响

丁苯酞对慢性酒精中毒大鼠海马内硫化氢和纤维状肌动蛋白的影响

徐磊1姜洪波2安娜1董献红1杜爱林1张瑞岭1，3

(新乡医学院第二附属医院,河南新乡453003)

摘要〔〕目的探究丁苯酞(NBP)对慢性酒精中毒大鼠学习记忆能力、海马内硫化氢(H2S)和纤维状肌动蛋白(F-actin)含量的影响。 方法 将50只SD雄性大鼠随机分为5组，除对照组外，将含酒的水作为大鼠唯一水来源，并逐渐增加酒精含量，采用自由饮用方法建立慢性酒精中毒模型。42 d后按慢性酒精中毒大鼠戒断评分表于末次饮酒后6 h检测大鼠模型，NBP低、中、高剂量组大鼠灌胃不同剂量NBP(大约14 d)，饮酒结束后利用Y型电迷宫测试酒精中毒大鼠的学习记忆能力，随后检测海马组织H2S和F-actin的含量。结果与对照组大鼠学习记忆成绩(40.38±5.97)、H2S含量(23.25±3.61)和F-actin在阳性细胞中的表达相比，模型组大鼠学习记忆成绩(83.25±5.47)和H2S含量(43.86±6.95)均升高，F-actin的阳性表达降低(P<0.01)。与模型组大鼠相比，NBP中、高剂量组大鼠学习记忆成绩(64.75±4.71)、(70.00±4.72)和H2S含量(32.21±5.32)、(36.78±7.29)nmol/g均降低，F-actin的阳性表达升高(P<0.01)。结论NBP能够减轻慢性酒精中毒大鼠对酒精的依赖，缓解酒精对大鼠学习记忆能力的影响，可能与NBP影响H2S和F-actin的含量有关。

关键词〔〕丁苯酞；慢性酒精中毒；纤维状肌动蛋白；硫化氢；学习记忆能力

中图分类号〔〕R39〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金(81471351)；河南省教育厅课题(15A310006)；河南省卫生科技创新型人才工程专项(3052)

通讯作者：杜爱林(1972-)，男，硕士，主要从事神经损伤及干预研究。张瑞岭(1967-)，男，教授，主任医师,硕士生导师，主要从事成瘾行为与精神药理研究。

The effect of Butylphthalide on H2S and F-actin in hippocampus of chronic alcoholism rats

XU Lei,JIANG Hong-Bo,AN Na,etal.

The Second Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Xinxiang 453003,Henan,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of butylphthalide(NBP)on the learning and memory abilities of chronic alcoholism rats,H2S content and the expression of F-actin in the hippocampus of chronic alcoholism rats.Methods 50 male SD rats were randomly divided into five groups.in addition to control group,the rats were reared by the water containing wine.The alcohol content was gradually increased to establish the free drinking modeling. After 42 d, 6 h after drinking rat models were detected by chronic alcoholism withdrawal score sheet.The low,medium and high dose NBP group rats were fed different doses of NBP,the learning and memory were tested bya Y-shaped maze detection the H2S content of the hippocampus and the expression of F-actin were measured.ResultsCompared to learning and memory scores(40.38±5.97),H2S content(23.25±3.61)and the expression of F-actin in control group rats，learning and memory scores (83.25±5.47) and H2S content (43.86±6.95) in rats of model group were increased and F-actin positive expression was reduced(P<0.01). Compared with those of model group, learning and memory scores (64.75±4.71) (70.00± 4.72) and H2S content (32.21±5.32) (36.78±7.29) in medium, high dose NBP group were reduced and F-actin positive expression was increased (P<0.05).ConclusionsNBP could reduce of chronic alcoholism rat alcohol dependence, and mitigate the impact of alcohol on learning and memory abilities of rats with NBP might affect H2S and F-actin contents relevant.

【Key words】Butylphthalide;Chronic alcoholism;F-actin; H2S;Learning and memory abilities

1新乡医学院2新乡医学院第三附属医院

3河南省生物精神病学重点实验室

第一作者：徐磊(1991-)，男，在读本科，主要从事神经损伤及干预研究。

长期饮酒可以导致中枢和周围神经系统损害，出现酒精中毒症状〔1〕。丁苯酞(NBP)是我国成功研制出的具有自主知识产权的一类化学新药，具有改善全脑缺血后Ca2+能量代谢、抑制Ca2+内流、保护线粒体功能、减轻神经功能损伤程度等作用〔2，3〕。可使硫化氢(H2S)的生成量增加，尤其钙离子/钙调蛋白介导的信号转导途径，可快速激活H2S的主要调节酶，使H2S大量生成〔4〕。细胞骨架是维持细胞正常形态与功能的重要结构，其中纤维状肌动蛋白(F-actin)是细胞骨架中的重要部分，其完整对于维持内皮细胞的正常功能是必需的〔5〕。本实验通过观察NBP作用于慢性酒精中毒大鼠后海马内H2S和F-actin的含量及大鼠学习记忆能力，探讨NBP对慢性酒精中毒大鼠行为和组织损伤的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物和分组清洁级健康SD雄性大鼠50只，由郑州大学动物中心提供，体重120~160 g。实验室中饲养4～6 d以适应实验室环境，按随机数字表法分为对照组、模型组、NBP低剂量组、NBP中剂量组、NBP高剂量组，10只。

1.1.2主要仪器和试剂Bio-Tek ELx800酶标仪由美国Bio-Tek公司提供。高速冷冻离心机购自德国Heraeus公司。超低温冰箱由美国Thermo Forma公司生产。微量加样器购自德国Eppendorf公司。FA1004电子分析天平购自上海泸奥明科学仪器有限公司。Y型电迷宫由上海移数信息科技有限公司生产。NaHS由美国Acros公司提供。兔抗F-actin抗体购自北京Solarbio公司。SP试剂盒由中国博奥森公司生产。DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。NBP由石药集团恩必普药业有限公司提供。其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.2方法

1.2.1模型制作和处理除对照组外，各组以酒精水溶液作为大鼠唯一水来源,以6%(V/V)酒精浓度开始,逐日递增1%(V/V)至15%(V/V)以后一直维持该浓度持续42 d,酒精溶液每日9：00配制、置换，任意进食。饮酒结束后按Gray等〔6〕慢性酒精中毒大鼠戒断评分表于末次饮酒后6 h检测大鼠模型是否成功。然用植物油稀释NBP灌胃1次/d，剂量为低剂量组NBP 10 mg/kg，中剂量组NBP 20 mg/kg，高剂量组NBP40 mg/kg，对照组予等剂量植物油灌胃5 ml/kg(大约14 d)。

1.2.2学习记忆能力评价各组大鼠进行Y型电迷宫测试，Y型电迷宫分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个臂，随机作为安全区。每臂顶端设一个信号灯,灯亮后提示此臂为安全区。所有学习记忆测试均于晚间安静、暗光下进行，将大鼠置于迷宫中,将3条臂的指示灯均打开,让其适应环境,3 min后将灯熄灭。随机打开其中一臂的指示灯,不亮的两臂自动延迟5 s后通电电击大鼠,直至逃避到安全区为止,然后灯亮持续15 s后熄灭,完成1次测试。大鼠在10 s内1次直接逃至安全区为正确反应,否则为错误反应。以10次电刺激后有9次做出正确反应为学会,用大鼠学会所需训练的次数表示其空间分辨反应的学习记忆成绩,训练次数越少,说明大鼠学习能力越强。

1.2.3海马内H2S含量的测定采用亚甲蓝分光光度法〔3〕。海马组织用研磨管在-20℃下进行研磨，倒入5 ml玻璃试管中，用冰预冷的50 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 8.0)匀浆(1.2 g/L)，12 000 r/min，4℃，离心10 min，取0.1 ml上清液，移至另一离心管中，在室温下加入1%醋酸锌0.5 ml，振荡混匀，孵育10 min，然后依次加入20 mmol/L N，N-二甲基苯二胺0.5 ml及30 mmol/L三氯化铁0.5 ml，室温孵育20 min使之充分显色，再加入10%三氯乙酸1 ml和三蒸水2.5 ml，再次离心(6 000 r/min，4℃，10 min)，收集清澈的上清液，使用美国Bio-Tek ELx800全自动酶标仪检测其吸光度，在波长670 nm处测定吸光度，根据H2S标准曲线计算溶液中的H2S含量，海马组织中H2S含量以单位重量的组织H2S的量(nmol/g)表示。

1.2.4组织内F-actin含量检测各组大鼠经4%多聚甲醛(4℃)灌注，断头取脑，进行固定、脱水、透明、浸蜡后制作蜡块，石蜡切片经脱蜡复水后，进行抗原修复和免疫组化，DAB显色，常规脱水、透明、中性树胶封片，显微镜观察并摄片。在高倍显微镜(400倍)下每张切片随机摄取双侧海马CA1 区各4个视野图片，用Image-pro-plus 6.0 图像处理软件对F-actin的阳性表达情况进行分析，以其平均光密度值作为统计数据，取其平均值作为判断F-actin的阳性表达情况。

2结果

2.1各组大鼠学习记忆成绩在Y型电迷宫测试实验中，模型组大鼠与对照组比较学习和记忆能力降低,表现为大鼠学会空间分辨所需训练次数增高(P<0.01)；给予NBP干预后，中、高剂量组大鼠训练次数减少(P< 0.01)，而低剂量组大鼠与模型组无明显差异。见表1。

2.2海马组织中H2S的含量变化模型组大鼠与对照组相比，后海马组织内的H2S含量明显增高(P<0.01)；给予NBP干预后，低剂量组大鼠与模型组比较，海马组织内H2S浓度无统计学差异(P>0. 05)；而NBP中、高剂量组大鼠与模型组相比，海马组织中H2S含量均降低(P<0.01)。见表1。

2.3海马组织中F-actin的蛋白表达与对照组比较，模型组大鼠海马神经元F-actin阳性表达平均光密度值明显降低(P<0.01)；给予NBP干预后，与模型组相比，低剂量组大鼠海马内细胞F-actin阳性表达与模型组无明显差异(P>0.05)；而中、高剂量组大鼠海马组织中F-actin阳性细胞表达升高(P<0.01)。见图1，表1。

图1　各组大鼠海马CA1区F-actin蛋白表达(×400)

表1　各组大鼠学习记忆能力评价、H 2S含量及

与正常对照组比较：1)P<0.01，与模型组比较:2)P<0.01

3讨论

慢性酒精中毒是一种进行性、潜在的可以致人死亡的疾病，表现为对饮酒的强烈渴望、耐受性增加、依赖性增强和不加以控制。过量饮酒可致脑组织氧化损伤，造成大脑学习记忆、认知判断等功能障碍，出现神经行为异常，不仅严重损害患者的身体健康，而且极易引发一系列的社会问题。目前，国内常采用灌胃和腹腔注射等方法建立长期饮酒的实验模型，本实验参考国外相关文献，采用自由饮模型。有研究〔7~10〕显示饮用酒精可引起学习、记忆、智力水平下降和精神行为功能缺陷。本实验结果也说明NBP能够缓解酒精中毒对大鼠智力水平的损伤，增强学习记忆能力。H2S 被认为是体内继CO、NO之后的第3个气体信号分子。脑内含硫氨基酸(蛋氨酸)代谢生成半胱氨酸后，在胱硫醚-β-合酶(CBS)等催化下生成H2S〔11〕。生理浓度的H2S具有舒张血管，增加微循环；抗氧化应激，抑制炎性反应；维持大鼠学习、记忆、智力水平〔12〕等生物学效应。而高浓度的H2S对活体器官具有毒性作用：一方面体现在对中枢神经系统的抑制作用，特异性地抑制兴奋性突触后膜电位 (这种作用是可逆的),从而阻滞突触传递，抑制神经元的功能〔13，14〕。另一方面通过增强NMDA受体介导的钙超载,使线粒体肿胀、能量代谢障碍和细胞逐步坏死〔15，16〕。而慢性酒精中毒可以激活CBS,催化H2S的大量形成〔11〕。

肌动蛋白(actin)是真核细胞最主要的骨架成分之一，它以单体(G-actin)和纤维状(F-actin)两种形式存在，并且单体与纤维状肌动蛋白之间可以相互转换〔17〕。国外相关研究证明，酒精的主要成分乙醇及其代谢产物乙醛、氧自由基的增加及高浓度H2S的毒性效应，一方面可以激活NMDA受体，使受体门控钙通道开放，胞质Ca2+浓度持续增高；细胞内Ca2+在调节细胞骨架的装配与分解中起着重要的作用，高浓度Ca2+可以降解神经元细胞骨架、膜蛋白及底物酶，损害细胞结构和功能；另一方面可以使F-actin的装配能量不足和分解加剧，发生细胞内F-actin含量降低，使细胞骨架发生溶解、重构、塌陷，改变突触结构，阻滞突触传递，引发神经元功能障碍，降低其学习记忆能力。

本研究结果表明，NBP可能通过使酒精中毒所致的高浓度H2S含量减少，进而抑制Ca2+内流，减轻细胞内Ca2+超载，减轻酒精对F-actin的损伤，保护神经元的结构和功能，使慢性酒精中毒大鼠学习记忆能力增加和智力水平上升。

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〔2014-07-15修回〕

(编辑徐杰)