一种新型肽对Lewis肿瘤细胞凋亡的影响

一种新型肽对Lewis肿瘤细胞凋亡的影响

孙洋刘爽徐静1王慧1周庆伟2

(吉林大学药学院，吉林长春130021)

摘要〔〕目的探讨新型肽对Lewis肿瘤细胞凋亡作用的影响。方法采用吖橙啶/溴乙啶(AO/EB)及线粒体膜电位法检测Lewis肿瘤细胞在48 h细胞凋亡情况，荧光显微镜观察AO/EB双染法检测细胞凋亡及线粒体膜电位的变化。结果新型肽对Lewis细胞具有明显促进凋亡的作用。荧光显微镜下观察：新型肽(2 000 μg/ml)治疗组可见典型的细胞凋亡形态学特征性改变；线粒体膜电位显著降低；细胞凋亡率明显增加分别与空白对照及新型肽(1 000 μl/ml)治疗组比较均有统计学差异(P<0.05)。结论新型肽可能通过降低Lewis肿瘤细胞线粒体膜电位，诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤生长作用。

关键词〔〕新型肽；Lewis肿瘤细胞；细胞凋亡；线粒体膜电位

中图分类号〔〕R73〔文献标识码〕A〔

通讯作者：周庆伟(1959-)，男，教授，主要从事药理学研究。

1长春中医药大学附属医院2吉林大学再生医学科学研究所

第一作者：孙洋(1990-)，女，在读硕士，主要从事生物药学研究。

目前肺癌的发病机制尚未十分清楚，研究显示，肿瘤的发生、发展与细胞凋亡密切相关〔1～3〕。其传统的治疗原则是术后先放疗后化疗，或单独放疗/化疗，但都难以提高其临床疗效〔4〕，其治愈率仍较低。目前国内外已研究的抗肿瘤药物众多，但多数价格昂贵且不良反应大。同时也存在耐药性问题，使其临床应用受到一定限制〔5～7〕。为此，寻找高效、低毒、价廉的新的治疗药物已成为近年来研究的热点。本实验旨在研究一种新型肽对Lewis肿瘤细胞凋亡作用的影响，并通过检测Lewis细胞凋亡及线粒体膜电位等变化，初步探讨其抑制作用的可能机制，为进一步研究新型肽在临床上治疗肺肿瘤提供新的理论依据。

1材料与方法

1.1细胞、主要试剂及药品 Lewis细胞株：购自中国科学院上海细胞生物学研究所。主要试剂：(1)线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1，产品编号：C2006)；(2)吖橙啶( 中国北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司 批号：1AB10220)；(3) 新型肽为本研究室设计，由中国 上海吉尔公司合成，纯度为98%；(4)博来霉素(浙江海正药业股份有限公司，批号：2131001)；(5)标准胎牛血清(天津灏洋生物制品科技有限责任公司，批号：TBD31HB)。

1.2主要仪器(1)荧光显微镜 NiKon ECLIPSE 80i (日本尼康公司)；(2)二氧化碳培养箱 ( 日本 三样电机株式会社制造 产品型号：NCO-15AC)；(3) AN YANG 超净台 (中国 苏州安洋科技发展有限公司 型号：BSC-BOOⅡB2)。

1.3方法

1.3.1吖橙啶/溴乙啶(AO/EB)双染细胞爬片取对数生长期Lewis肿瘤细胞，0.25%胰酶消化计数。调整细胞悬液3×105Cells/ml接种6孔板中，1 ml/孔，37℃、5% CO2培养4 h，细胞贴壁； 随机分为空白对照组、博来霉素组及不同浓度新型肽(1 000、1 500及2 000 μg/ml)组，每组设2个复孔，50 μl/孔，每孔终体积2 ml。置入37℃，5% CO2培养48 h；③ 取出爬满细胞的盖玻片置于载玻片上，在盖玻片上滴加AO和EB染液各5 μl。立即在荧光显微镜下观察、拍照。每个视野计数所含的程序性死亡细胞数，取其均数计算细胞程序性凋亡率。

1.3.2JC-1染色检测线粒体膜电位 取对数生长期Lewis肿瘤细胞，常规消化后制成单细胞悬液，调整细胞数为3.0×105/ml，接种在6孔板，1 ml/孔。置入37℃，5% CO2孵育4 h，细胞贴壁；随机分为CCCP阳性对照组、空白对照组、博来霉素(100 μg/ml)组及不同的浓度新型肽(1 000、1 500及2 000 μg/ml)组，50 μl/孔，每组设2个复孔，每孔终体积2 ml。置入37℃，5% CO2培养48 h。CCCP组(作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照)，每孔加入CCCP(CCCP按照1∶1 000的比例加入到细胞培养液中) 。博来霉素组与不同浓度的新型肽组每孔加入0.5 ml JC-1染色工作液。37℃孵育20 min后，弃掉上清液，用冰浴JC-1(1X)缓冲液冲洗细胞2次后，每孔加入1 ml培养液。荧光显微镜下观察，激发波长为490 nm，发射波长530 nm。拍照。

1.4统计学分析采用SPSS13.0软件进行t检验。

2结果

2.1AO/EB双染荧光染色对细胞凋亡形态观察新型肽作用于Lewis肿瘤细胞48 h，采用AO/EB染色，在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。结果显示，空白对照组可见大量被染成的绿色细胞，细胞呈梭形，胞核完整，界限清楚。随着药物浓度的增加，正常细胞数目逐渐减少，凋亡细胞数目显著增多，其细胞核和(或)细胞质发出红色荧光。新型肽(2 000 μg/ml)组细胞凋亡率〔(20.24±0.34)%〕分别与空白对照组〔(5.44±0.99)%〕及新型肽(1 000 μg/ml)组〔(10.66±0.32)%〕比较具有显著性差异(P<0.05)；新型肽(2 000 μg/ml)组与博来霉素组〔(20.38±0.19)%〕比较无统计学意义(P>0.05)另外新型肽(1 500 μg/ml)凋亡率为〔(15.20±0.22)%〕，见图1。

2.2新型肽对Lewis肿瘤细胞线粒体膜电位的影响荧光显微镜下可见，CCCP阳性对照组，经10 μmol/L浓度处理20 min后C6脑神经胶质瘤细胞线粒体的膜电位完全丧失JC-1染色后呈绿色荧光。空白对照组，大多数细胞染色呈红色荧光。新型肽(2 000 μg/ml)组作用于Lewis肿瘤细胞48 h：多数细胞呈绿色荧光，细胞呈梭形，提示细胞发生凋亡；红色荧光的细胞呈园形，但突起较正常对照组和新型肽(1 000 μg/ml)组及新型肿瘤抑素(1 500 μg/ml)组的红色荧光细胞呈圆形。各实验组细胞线粒体膜电位均有不同程度下降，新型肽(2 000 μg/ml)组〔(28.18±0.19)%〕分别与空白对照组〔(11.06±0.37)%〕及新型肽(1 000 μg/ml)组〔(16.10±0.16)%〕比较具有显著差异(P<0.05)，新型肽(2 000 μg/ml)组与博来霉素组〔(28.12±0.24)%〕比较无统计学意义(P>0.05)，CCCP组为100%,新型肽(1 500 μg/ml)为〔(22.14±0.21)%〕。见图2。

图1　新型肽对Lewis肿瘤细胞48 h凋亡的作用(×20)

图2　新型肽对Lewis肿瘤细胞线粒体膜电位的影响(×20)

3讨论

恶性肿瘤由基因变异所导致并呈无限增殖、凋亡机制紊乱等特点，已经成为全世界最主要的死亡原因之一。鉴于传统抗肿瘤药物往往选择性差、毒副作用大，其治愈率仍较低。对其治疗至今尚无突破性进展。为此，寻找高效、低毒、疗效稳定的抗肿瘤药物是目前研究开发的重点，而新型的多肽药物恰恰具备了这些优点。肿瘤的发生是多途径、多步骤的，还与细胞凋亡有关，细胞增殖与凋亡之间的平衡失调与肿瘤的发生、发展密切相关。因此，抑制肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡已成为肿瘤治疗的重要手段之一〔8～11〕。本实验结果说明随着药物浓度的增加，凋亡细胞比例逐渐增加。

JC-1是广泛用于检测线粒体膜电位的一种理想光探针。在线粒体膜电位较高时，JC-1集聚在线粒体基质中，形成聚合物，产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能集聚在线粒体基质中，此时成为单体状态，产生绿色荧光。这样通过光颜色就可以非常方便地检测线粒体膜电位的变化。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件〔12，13〕。本研究表明新型肽可能直接作用于Lewis细胞线粒体，使线粒体膜通透性增加，线粒体跨膜电位下降，从而诱导细胞凋亡的发生。

综上，新型肽可使线粒体膜电位下降，诱导Lewis肿瘤细胞凋亡，其诱导凋亡的分子机制可能与线粒体膜电位下降有关。

4参考文献

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〔2015-04-25修回〕

(编辑曲莉/滕欣航)