黄芪总皂苷对内质网应激诱导的心肌细胞肥大模型的保护作用

黄芪总皂苷对内质网应激诱导的心肌细胞肥大模型的保护作用

顾静李海龙刘凯李应东明海霞李杨吴红彦

(甘肃中医学院基础课部甘肃省中医方药挖掘与创新转化重点实验室，甘肃兰州730000)

摘要〔〕目的观察内质网应激(ERS)对心肌肥大的影响，探讨黄芪总皂苷对ERS诱导的心肌细胞肥大的保护作用。方法心肌细胞原代培养，实验分为对照组、衣霉素(TM)组、黄芪总皂苷联合TM(AST+TM)组。通过测定心肌细胞蛋白质合成速度、心肌细胞表面积观察心肌细胞肥大，通过内质网染色以及RT-PCR检测葡萄糖调节蛋白(GRP78)和C/EBP同源蛋白(CHOP)mRNA的表达观察心肌细胞ERS反应。结果与对照组相比，TM组心肌细胞蛋白质合成速度提高、心肌细胞表面积增加，ERS分子GRP78和CHOP mRNA表达增加，均有显著性差异(P<0.01)，内质网形态改变与TM组相比，AST+TM组心肌细胞蛋白质合成速度降低、心肌细胞表面积减小， GRP78和CHOP mRNA表达降低，均有显著性差异(P<0.01)，内质网形态恢复，与对照组类似。结论ERS诱导剂TM诱导心肌细胞显著肥大,同时伴随ERS反应，黄芪总皂苷可以通过减弱ERS反应而抑制TM诱导的心肌细胞肥大。

关键词〔〕内质网应激；心肌细胞；心肌肥大；黄芪皂苷

中图分类号〔〕R542.2〔文献标识码〕A〔

基金项目：甘肃省中药管理局项目(GZK-2014-79)；高校基本科研业务费(GZY2012-1)；甘肃省自然科学基金项目(1310RJZA088)

通讯作者：吴红彦(1963-)，男，教授，博士生导师，主要从事心脑血管疾病临床与基础研究。

第一作者：顾静(1980-)，女，副教授，博士，主要从事心血管药理生理学和循证中医药研究。

内质网应激(ERS)近年来受到高度关注，适度的ERS是一种进化上高度保守的细胞保护机制，有助于细胞内钙和蛋白质加工等稳态恢复正常，增强细胞耐受应激刺激的能力；但是持续而严重的ERS触发细胞凋亡，造成细胞损伤。多种致心肌肥大因素，如压力过负荷、自身免疫性心肌病、缺血缺氧、糖尿病性心肌病、血管活性物质异常和慢性酒精中毒致心肌肥大过程中均出现ERS反应〔1～6〕，提示ERS反应可能是上述因素致心肌肥大发生、发展的机制之一。黄芪具有多方面的药理作用特别是具有明显的心血管作用，包括强心作用，对心肌缺血、缺血/再灌损伤以及感染病毒心肌具有明显的保护作用，其机制主要与黄芪调节细胞内钙有关，而钙稳态失衡是ERS的一个重要方面。本文研究黄芪总皂苷对ERS诱导的心肌细胞肥大模型的影响，探讨黄芪对心肌的保护是否通过ERS途径起作用。

1材料与仪器

1.1细胞小鼠原代心肌细胞购自齐氏生物科技有限公司。

1.2药物与试剂胰蛋白酶、DMSO均购自Amresco公司，DMEM/F12和胎牛血清购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司，批号分别是:NYB0810和NY0814，黄芪总皂苷(AST)购自上海源叶生物试剂有限公司，批号:ZA0424LA13，衣霉素(TM)购自美国Sigma公司，〔3H〕-亮氨酸购自英国GE Healthcare公司，GENMED内质网(ER)形态染色试剂盒购自美国Genmed Science Inc 公司。

1.3仪器CO2培养箱(SANYO Electric Co Ltd,型号：MAO-18ALC),超净工作台(苏州净化仪器厂，型号：SW-CJ-2FD),倒置荧光显微镜CK2(日本Olympus公司),多功能液闪仪LS6500型(美国Beckman公司)。

1.4方法

1.4.1心肌细胞培养及分组将小鼠心肌细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，培养条件：37℃、100% 湿度、5%CO2、95%空气，每48小时换液一次。实验分为3组：①对照组：细胞置CO2孵箱37℃常规培养至实验结束。②TM组：培养液内加入TM(10 ng/ml通过预试验确定)处理心肌细胞72 h。③TM+AST组：细胞培养液内同时加入AST(终浓度10 ng/ml通过预试验确定)和TM(终浓度为10 ng/ml)孵育72 h结束实验。

1.4.2蛋白质合成速率测定采用〔3H〕-亮氨酸掺入技术测定心肌细胞蛋白质合成速率。实验结束前12 h，按照0.5 μCi/孔加入〔3H〕-亮氨酸孵育12 h。实验结束后用预冷PBS冲洗细胞3次，每孔内加入150 μl甲酸，室温消化30 min后全部移入液闪瓶。LS6500多功能液闪仪检测心肌细胞〔3H〕-亮氨酸放射性强度，以每分钟校正计数(CCPM)表示。同时按照Bradford法蛋白定量方法测定每组心肌细胞蛋白含量，以每毫克蛋白CCPM反映各组蛋白质合成速率变化。

1.4.3心肌细胞表面积测定单个生长培养细胞，置于Olympus倒置显微镜下采集心肌细胞图像，采用Image-Pro Plus软件分析各组心肌细胞表面积。

1.4.4ER染色获得单个生长培养细胞，按照GENMEDER染色试剂盒操作说明进行ER染色，在激光共聚焦显微镜下观察：激发波长370 nm，散发波长460 nm(ER呈现蓝色)。

1.4.5RT-PCR技术检测ERS标志性基因CHOP、GRP78mRNA表达收集各组细胞，用TRIzol试剂提取各组细胞总RNA，鉴定RNA完整性和纯度。GAPDH引物序列正义链5'-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3'， 反义链5'-TCACCATCTTTCCAGGAGCGAG-3'； CHOP引物序列正义链5'-AGCTGGAAGCCTGGTATGAG-3'， 反义链5'-GACCACTCTGTTTCCGTTTC-3'；GRP78引物序列正义链5'-TCTGGTTGGCGGATCTACTC-3'， 反义链5'-TCTTTTGTCAGGGGTCGTTC-3'。PCR反应参数为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环后，72℃延伸10 min，4℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统拍照并对DNA目的条带进行扫描，以GAPDH为内参分析各基因相对表达水平。

1.5统计学方法应用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析及t检验。

2结果

2.1心肌细胞蛋白质合成速率 10 ng/ml TM作用72 h，心肌细胞蛋白质合成速率较对照组增加204.76%(P<0.05)；10 ng/ml AST联合10 ng/ml TM共同作用72 h，心肌细胞蛋白质合成速率较10 ng/ml TM组下降46.88%(P<0.05)，与对照组相比增加了61.98%(P<0.05)，提示AST能抑制TM诱导的心肌细胞蛋白质合成速率的增加，缓解蛋白质合成增加造成的心肌细胞肥大。

2.2心肌细胞表面积测定10 ng/ml TM作用72 h，心肌细胞表面积较对照组增加100.5%(P<0.05)；10 ng/ml AST联合10 ng/ml TM共同作用72 h，心肌细胞表面积较10 ng/ml TM组显著下降40.70%(P<0.05)，与对照组相比增加了19.1%(P>0.05)，提示AST能部分地抑制TM诱导的心肌细胞表面积增加。

2.3ER形态变化采用ER特异性染料Dapoxyl观察心肌细胞ER形态改变，激光共聚焦显微镜观察显示正常心肌细胞ER均匀分布在核周，无空泡出现；10 ng/ml TM作用72 h后心肌细胞ER结构严重受损，荧光颗粒分布不均、浓集，并有空泡形成，表明ER应激诱导剂TM诱导心肌细胞ER显著损伤，出现ERS；10 ng/ml AST联合10 ng/ml TM共同作用72 h，上述结构损伤减弱或未见。

2.4ERS分子表达变化前述实验证实10 ng/ml TM作用72 h心肌细胞显著肥大，我们在该肥大模型上观察了ERS分子的表达变化及10 ng/ml AST对其影响。RT-PCR证实10 ng/ml TM作用72 h诱导心肌细胞ERS分子显著增加，CHOP、GRP78 mRNA表达较对照组增加265.45%和172.33%(P<0.05)；10 ng/ml AST联合10 ng/ml TM共同作用72 h，CHOP、GRP78 mRNA表达较TM组分别降低了64.38%和55.88%(P<0.05)，与对照组相比分别增加了21.12%和32.1%无显著差异(P>0.05)。 CHOP、GRP78是ERS的重要标志性蛋白，上述结果提示TM诱导心肌细胞显著ERS，AST能抑制TM诱导的ERS标志蛋白的表达，见图1。

1，2：对照组；3、4：TM组；5、6：AST+TM组 图1　心肌细胞ERS分子表达

3讨论

慢性心肌肥大向心力衰竭发展的过程是心脏重构的过程，这一病理过程包括心肌细胞体积增大、直径增宽或长度增加，并伴随着坏死、凋亡造成的心肌细胞丢失，以及间质纤维化等，整体表现为心脏重量增加，室壁变厚，功能减弱。Hamada等〔4〕曾使用抑制蛋白质糖基化而诱导ERS的TM观察心肌细胞ERS分子的表达，在KDEL受体突变的心肌细胞ER内GRP78的表达明显增加，并出现ERS相关凋亡途径的标志分子CHOP 聚集，提示蛋白质量控制异常引起的ERS相关心肌细胞凋亡是KDEL受体突变小鼠扩张型心肌病发生的重要机制。

未折叠蛋白反应(UPR)是研究最为充分的一类ERS反应，与心肌肥大的发病密切相关，主要表现为蛋白质合成暂停、ER功能相关蛋白质表达上调〔7〕以及促进ER内错误折叠蛋白质降解，以重建ER内环境稳态。目前认为ERS时蛋白质合成调节主要涉及三个ER跨膜效应蛋白:PERK、铁反应元件(IRE)1和激活型转录因子(ATF)6〔8〕。正常情况下，这三种蛋白的ER腔侧都与GRP78结合而处于无活性状态，当ER腔内未折叠蛋白/错误折叠蛋白聚集超过ER处理范围时，GRP78即从这三种蛋白上解离而与未折叠蛋白/误折叠蛋白结合以协助其正确折叠，GRP78的解离促进PERK、IRE1、ATF6活化进而触发ERS信号转导。当ERS延长时，激活转录因子(ATF)4持续表达介导参与细胞凋亡基因的上调，如ATF4诱导CHOP〔9〕表达。可见，细胞一方面积极调动应激反应蛋白(如GRP78、ATF6、ATF4等)的表达以抵御病理因素造成的细胞损伤，调整ER功能以适应新的内环境变化要求，另一方面诱导凋亡相关基因CHOP表达增加，以清除功能不能恢复的细胞。

本实验发现，① TM诱导培养心肌细胞发生ERS反应，表现为ERS的标志分子GRP78 mRNA表达上调，心肌细胞ER形态严重破坏，荧光颗粒分布不均，ER内出现空泡；②ERS诱导剂TM也显著诱导培养心肌细胞肥大，表现为心肌蛋白质合成速率增加和细胞表面积增加；③ TM促进心肌细胞CHOP表达增加，说明ERS激活心肌细胞CHOP凋亡相关途径并参与了TM诱导的肥大心肌细胞损伤，由此进一步证实ERS参与了心肌肥大的发生、发展过程。

此外，本实验表明AST有显著抑制心肌细胞肥大的效应；与此同时心肌细胞ER的形态和ERS相关分子GRP78、CHOP表达也趋于正常，这提示AST抑制心肌细胞肥大可能与其抑制ERS有关，但其具体机制尚不清楚，有待进一步研究。

4参考文献

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4Hamada H，Suzuki M，Yuasa S,etal.Dilated cardiomyopathy caused by aberrant endoplasmic reticulum quality control in mutant KDEL receptor transgenic mice〔J〕.Mol Cell Biol,2004;24(18):8007-17.

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〔2013-12-30修回〕

(编辑苑云杰/曹梦园)