气相色谱－质谱法测定鱼肉中丁香酚的残留

余颖

(福建省水产研究所，福建厦门 361013)

0 引言

为了使水产品在运输过程中保持鲜活，减少因应激性反应造成缺氧或皮肤损伤而导致的经济损失，国内近年普遍使用鱼用麻醉剂来提高水产品运输过程中的保活率．鱼用麻醉剂是一类能不同程度抑制鱼脑感觉中枢，使鱼失去反射动作的物质［1］．常用的鱼用麻醉剂中，丁香酚以其高效、低价、高安全性，近年来受到广泛关注．丁香酚，化学名为2－甲氧－4丙烯基酚，是一种香料，可作为全麻剂，对鱼有强烈的麻醉作用，被广泛应用于亲鱼采卵及活鱼运输中［2］．日本允许使用丁香酚作为鱼用麻醉剂，日本肯定列表规定了丁香酚的最高残留限量为0．05 mg·kg－1［3］．而我国尚未有丁香酚最高残留限量的规定．2010年11月，厦门首次查获一起用丁香酚麻醉活鱼以提高存活率的案件，引发消费者对鱼用麻醉剂的恐慌［4］．Kildea等［5］研究发现，对鱼类进行重复麻醉会降低鱼体净化自身体内残留麻醉剂的能力．目前国内尚缺少对鱼用麻醉剂有效的监管制度及使用安全性的权威判定，若人体通过摄食鱼类摄入过量的鱼用麻醉剂而对健康造成影响，将引起公众对鱼用麻醉剂安全性的担忧，则不利于水产经济的健康发展．

目前，国内对丁香酚的检测多应用于食品及药品中，水产品中丁香酚残留的检测还未见报道．食品及药品中丁香酚的检测方法主要有以下几类:①液相色谱类，主要有高效液相色谱法［6－8］、固相萃取－高效液相色谱法［9］、反相高效液相色谱法［10］等;②气相色谱法［11］;③气相色谱 －质谱联用法［12－13］;④液相色谱－质谱联用法，如液－液萃取－液相色谱－串联质谱法［14］;⑤其它方法，如高效毛细管电泳法［15］等．这几类方法的检出限为7．4×10－4～3．5 g·kg－1不等．由于水产品富含蛋白质、脂肪及色素，样品基质复杂，且丁香酚在水产品中的残留量相对于食品及药品中丁香酚含量较低，食品药品的前处理方法及检出限水平不适用于水产品中丁香酚痕量残留的检测．采用气相色谱－质谱联用法测定丁香酚在鱼肉中的残留量，定性及定量准确且灵敏度高，能满足水产品中鱼用麻醉剂残留量日常检测的需要，为水产行业对鱼用麻醉剂的监管提供依据．

1 材料与方法

1．1 主要仪器和试剂

Trace DSQ气相色谱－质谱联用仪(美国Thermo公司);MS3旋涡振荡器(德国IKA公司);KQ－250DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);LD4－8离心机(北京时代北利离心机有限公司);固相萃取装置(美国Alltech公司);HGC－24氮吹仪(天津恒奥科技发展有限公司)．

正己烷、乙酸乙酯为色谱纯;无水硫酸钠为分析纯(650℃灼烧4 h，冷却后贮于密闭容器中备用);硅胶柱(Phenomenex，Strata Si－1，1 000 mg/6 mL)．

丁香酚(CAS:97－53－0)、甲基丁香酚(CAS:93－15－2)标准品购于德国Dr．Ehrenstorfer．

1．2 样品处理

1．2．1 样品预处理

鲈鱼(Lateolabrax japonicus)、鳗鲡(Anguilla japonica)及石斑鱼(Epinephelussp)，取可食部分均质混匀，置于－18℃ 冰箱中备用．

1．2．2 提取

称取2 g样品(精确至0．01 g)置于50 mL塑料离心管中，加入10 mL正己烷，5 g无水硫酸钠，旋涡振荡1 min，超声提取5 min．然后在3 500 r·min－1离心10 min，将上清液转移到另一50 mL塑料离心管中．分别再用10 mL和5 mL正己烷重复提取，合并上清液．

1．2．3 净化

硅胶柱用3 mL正己烷活化，样液过柱，2 mL正己烷洗涤，吹干．7 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液．将洗脱液于40℃氮吹至约1 mL，加入质量浓度为2 mg·L－1的甲基丁香酚内标200μL，用乙酸乙酯定容到2 mL，供气相色谱－质谱分析．

1．3 分析条件

1．3．1 色谱条件

色谱柱:DB－5MS(30 m×0．25 mm×0．25μm);升温程序:起始温度80℃，保持0．5 min，以7℃·min－1升到122℃，保持15 min，再以7℃·min－1升到150℃，保持8．5 min，最后再以35℃·min－1升到240℃，保持4 min;进样口温度:270℃，进样方式:不分流进样，进样体积为1μL;载气:高纯氦气(纯度≥99．999%)，流速 1．0 mL·min－1．

1．3．2 质谱条件

离子源:EI源;电子能量:70 eV;离子源温度:270℃;传输线温度:260℃;溶剂延迟:5 min;采集方式:选择离子监测(SIM)模式．丁香酚的监测离子是:103、131、149、164，其中164为定量离子，各离子丰度比为22∶19∶37∶100;甲基丁香酚的监测离子是:91、147、163、178，其中178为定量离子，各离子丰度比为24∶43∶37∶100．

2 结果与讨论

2．1 丁香酚的气相色谱－质谱分析

按1．3的分析条件对0．2 mg·L－1丁香酚标准品和0．2 mg·L－1甲基丁香酚内标进行分析，选择离子色谱图如图1所示．程序升温可使丁香酚和甲基丁香酚实现较好的分离，保持基线稳定，目标峰峰形对称且附近干扰峰少，定性准确度高．色谱柱采用DB－5MS石英毛细管柱，柱流失小，适合用于质谱分析．

图1 丁香酚和甲基丁香酚标准溶液选择离子色谱图Fig．1 Chromatogram of eugenol and methyleugenol

2．2 样品前处理方法的研究

2．2．1 固相萃取柱的选择

水产品基质复杂，富含脂肪、蛋白质、色素等杂质，若不进行有效净化，将干扰丁香酚的定性定量分析，且会污染色谱柱和离子源．已有报道的丁香酚提取液的净化多采用固相萃取［9］及液－液萃取方式［14，16］．液－液萃取方式对水产品基质的净化效果不够理想，因此较常采用固相萃取方式．固相萃取的主要优势在于对复杂样品基质的净化效果较好，可减少质谱应用中的离子抑制或离子增强现象，并能对极低浓度的组分进行富集，适用于水产品中痕量残留的检测．

丁香酚属于弱极性分子，由于采用正己烷作为提取剂，大量脂质及类脂物质同时被提取出来，必须进行有效的脱脂处理．实验分别比较了相同规格的硅胶柱、中性氧化铝柱(Phenomenex，Strata AL－N，1 000 mg/6 mL)、弗罗里硅土柱(Phenomenex，Strata FL－PR，1 000 mg/6 mL)和氨基柱(Phenomenex，Strata NH2，1000 mg/6 mL)的净化效果，结果如表1．在四种固相萃取柱中，硅胶柱对丁香酚(添加浓度为50μg·kg－1)的回收率最高，且对于脂肪含量较高或较低的样品均能较好地去除杂质，因此实验采用硅胶柱为净化柱能满足分析要求．

表1 不同固相萃取柱的净化效果比较Tab．1 Comparison of purification effect of different SPE columns

2．2．2 洗脱液用量的优化

将2 g空白样品按1．2．2法提取，提取液加入丁香酚标准溶液(添加浓度为50μg·kg－1)，过硅胶柱，用乙酸乙酯洗脱，收集每毫升洗脱液，洗脱曲线如图2所示．在洗脱体积为7 mL时，丁香酚可完全洗脱，因此选用7 mL为最佳洗脱体积．

按优化后的样品前处理方法所得的鲈鱼、鳗鲡和石斑鱼的空白样品及加标样品选择离子色谱图见图3～5(丁香酚和内标甲基丁香酚的添加浓度都为50μg·kg－1)．结果表明，前处理过程简单，样品净化完全，目标峰附近无杂质峰干扰．采用固相萃取净化可有效地消除基质效应，保护色谱柱和离子源，提高方法灵敏度，且提取效率高．另外，方法采用内标法定量，可进一步消除基质效应，弥补外标法定量的不足．

图2 丁香酚洗脱曲线Fig．2 The eluting curve of eugenol

图3 鲈鱼空白样品和加标样品选择离子色谱图Fig．3 Chromatogram of weever blank sample and blank sample added with eugenol

图4 鳗鲡空白样品和加标样品选择离子色谱图Fig．4 Chromatogram of eel blank sample and blank sample added with eugenol

图5 石斑鱼空白样品和加标样品选择离子色谱图Fig．5 Chromatogram of grouper blank sample and blank sample added with eugenol

2．3 方法有效性的评价

2．3．1 线性范围、检出限和最低定量限

将丁香酚标准品和甲基丁香酚内标用乙酸乙酯配制成丁香酚质量浓度为0．005、0．01、0．025、0．05、0．1、0．25、0．5 mg·L－1及含甲基丁香酚内标质量浓度为0．2 mg·L－1的系列标准溶液，进行气相色谱 －质谱分析，内标法定量．以标准溶液与内标物的响应值之比为纵坐标，以标准溶液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算相关系数．得到线性回归方程为y=5．044 4x－0．007 3，在0．005～0．5 mg·L－1范围内线性关系良好，相关系数R为0．999 8．

方法检出限是在给定概率P=95%，显著水平为5%时，能够定性检出的最小浓度，常以信噪比≥3表示．实验中丁香酚在鲈鱼、鳗鲡和石斑鱼空白样品中加标浓度为5μg·kg－1时，平均回收率为76．5% ～125%，相对标准偏差为4．65% ～9．53%，信噪比在7～20之间，因此确定丁香酚的检出限为5μg·kg－1．

最低定量限是以空白测量值标准偏差的10倍相对应的浓度值，即10倍信噪比表示．实验中丁香酚在鲈鱼、鳗鲡和石斑鱼空白样品中加标浓度为10μg·kg－1时，平均回收率为82．4～95．3%，相对标准偏差为4．07% ～8．55%，且信噪比在25～36之间，因此，本方法确定丁香酚的最低定量限为10μg·kg－1．

2．3．2 方法的准确度和精密度

按1．2所述方法，分别在鲈鱼、鳗鲡和石斑鱼空白样品中添加不同浓度的丁香酚进行加标回收试验，添加浓度分别为10、50、200μg·kg－1，每个浓度水平重复6次．为了验证方法的再现性，又进行了这三个浓度水平的日间加标回收试验．结果如表2所示，日内平均回收率为82．6% ～93．2%，相对标准偏差为3．47% ～7．38%;日间平均回收率为80．6% ～89．3%，相对标准偏差为3．98% ～8．47%，均符合药残检测技术要求．

表2 加标样日内和日间平均回收率和相对标准偏差，n=6)Tab．2 Intra－day and inter－day average recoveries and RSDs of the spiked samples，n=6)

表2 加标样日内和日间平均回收率和相对标准偏差，n=6)Tab．2 Intra－day and inter－day average recoveries and RSDs of the spiked samples，n=6)

添加浓度/μg·kg－1 样品名称 日内 日间x/% RSD/%x/% RSD/%91．5 6．25 89．3 8．47鳗鲡 93．2 7．38 86．7 6．88石斑鱼鲈鱼10 88．5 5．50 80．6 5．63 86．3 5．46 84．8 6．18鳗鲡 87．6 6．38 84．9 7．44石斑鱼鲈鱼50 86．0 7．21 81．3 6．75 82．6 4．12 84．6 3．98鳗鲡 83．7 3．47 86．4 4．15石斑鱼鲈鱼200 87．3 6．98 85．6 5．78

3 结语

研究建立了一种鱼肉中丁香酚残留的气相色谱－质谱检测方法，样品预处理采用正己烷提取，硅胶柱净化，乙酸乙酯洗脱的方法，过程简单，缩短了样品检测周期，试剂用量少且毒性小、净化效果好，适合样品的批量检测．方法的灵敏度和稳定性较好，准确度和精密度均符合药残检测技术要求，可应用于养殖鱼类中丁香酚残留的日常检测．