亲水作用毛细管电色谱分析苷类药物的研究

吕海霞，易姣姣，赵婷婷，林旭聪，朱春玲

(1．福州大学材料科学与工程学院，福建福州 350116;2．福州大学化学学院，福建福州 350116)

0 引言

苷类物质是糖或糖的衍生物与非糖物质通过糖的端基碳原子连接而成的一类化合物，对心血管系统、呼吸系统疾病的治疗具有重要的作用．目前，对苷类药物的分析方法主要有毛细管电泳［1－2］和高效液相色谱［3－8］．在电泳方面，芦丁和连翘基于与运行液中SDS胶束的作用力不同而得到了分离．在色谱领域，常规的反相液相色谱(采用ODS填充柱)等度洗脱分离苷类药物耗时较长［5］，色谱峰展宽明显，一般需要采用梯度洗脱法［3，8］，操作复杂．建立一种简便高效的苷类药物检测方法，对于促进中药成分监测具有重要的意义．

亲水作用毛细管电色谱(HICEC)是近年来色谱领域研究的热点之一．基于强极性固定相，结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相，HICEC既可以解决反相色谱中极性物质不能有效地保留的问题，又能解决正相色谱中极性物质在流动相中的溶解性问题，已经在多肽、氨基酸等的检测分析中得到广泛应用［9－10］，是分离极性物质的好方法．目前在苷类药物分析中尚未见文献报道．

极性甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)和多面体低聚倍半硅氧烷POSS－MA聚合形成的poly(POSS－MA－co－HEMA)有机－硅胶杂化整体柱能够提供足够强的亲水位点，对于极性酰胺类物质和苯酚的分离性能突出［11］．因此，本文采用poly(POSS－MA－co－HEMA)整体柱，通过典型苷类药物的CEC亲水作用行为研究，建立了苷类药物的亲水作用毛细管电色谱分析技术，并分离检测了血清中的苷类药物，效果良好．

1 实验部分

1．1 仪器和试剂

Trisep－2010GV加压毛细管电色谱仪(上海通微分析技术有限公司);KQ－100E医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);PHS－3C型精密酸度计(上海大普仪器有限公司);BS 124S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);漩涡振荡器、DKB－501A型超声恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司);KDC－160HR高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)．poly(POSS－MA－co－HEMA)有机硅胶杂化整体柱(实验室自制)．

连翘苷(forsythin)、豆腐果苷(helicid)、紫丁香苷(syringin)和天麻素(gastrodin)标准品均购自中国生物药品检定所;乙腈(色谱纯，上海国药集团);其他试剂均为分析纯．实验用水为二次蒸馏水．

1．2 实验方法

采用流动相平衡poly(POSS－MA－co－HEMA)整体柱30 min，所采用的流动相 V乙腈∶V磷酸三乙胺缓冲液=90 ∶10(磷酸三乙胺缓冲液2 mmol·L－1，pH=7．0)．电色谱实验中，泵流速为 0．05 mL·min－1，分离电压为－8 kV，反压阀压力为5．4 MPa，检测波长为220 nm．

1．3 样品处理

取200μL血清于1．5 mL离心管中，加入600μL乙腈(ACN)，涡旋混匀1 min，置于离心机中，在1．3×104r·min－1下离心10 min，移取上清液100μL，与适量的四种苷类药物的标准液混合，配制成一系列混合血清样品溶液备用．

1．4 保留因子的计算

保留因子(k*)可用下式进行计算:

式中:tr和t0分别是溶质和不保留物质在毛细管电色谱中的保留时间，甲苯作为t0标记物．

2 结果与讨论

2．1 亲水作用电色谱行为分析

图1为poly(POSS－MA－co－HEMA)有机硅胶杂化整体柱柱内部聚合物的形貌．固定相为高度交联的多孔型聚合物，它与毛细管内壁紧密粘连在一起，骨架结构均匀，保证了溶质和固定相之间充分进行相互作用和整体柱的良好通透性．流动相中有机改性剂的浓度不仅影响流动相的流速，而且主要对溶质的保留有很大的影响．流动相的改变导致溶质在固定相和流动相中的分配系数发生变化，从而影响其分离选择性．图2为不同比例的乙腈(86% ～94%)对苷类药物分离影响．由图可知，四种苷类药物的保留因子k*值随着流动相中乙腈比例的增加而变大，而且k*值增强程度随着苷类药物极性(连翘苷、豆腐果苷、紫丁香苷和天麻素的log P值分别为0．16，－0．89，－1．07和－1．37)的增强而增强，表明苷类药物在poly(POSS－MA－co－HEMA)有机硅胶杂化整体柱上具有良好的亲水作用．

图1 整体柱横截面的电镜图Fig．1 SEM of monolithic column in cross section

图2 乙腈含量对四种苷类药物保留因子(k*)的影响Fig．2 Effects of ACN content on the retention factor(k*)of four glycosides

2．2 分离条件优化

2．2．1 流动相中乙腈比例的选择

流动相中不同乙腈比例(φACN=86% ～94%)下苷类药物的分离结果如图3所示，图中:0为甲苯;1为连翘苷;2为豆腐果苷;3为紫丁香苷;4为天麻素．随着流动相中乙腈比例的增高，流动相极性越小，极性强的苷类药物(紫丁香苷和天麻素)在亲水作用毛细管电色谱柱上的保留越强，相对保留时间增大，k*值增加有利于增加分离度．当流动相中乙腈比例为90%时，较难分离的豆腐果素和紫丁香苷可以实现基线分离，但分析时间延长．综合考虑分析时间和分离度，流动相中乙腈比例选择90%．

2．2．2 分离电压的影响

分离电压是CEC高效分离的主要驱动力之一．分离电压(U分离)为0～－12 kV时对四种苷类化合物的分离情况如图4所示，图中:0为甲苯;1为连翘苷;2为豆腐果苷;3为紫丁香苷;4为天麻素．增大分离电压，poly(POSS－MA－co－HEMA)有机硅胶杂化整体柱电渗流增大，分析物迁移时间减小;但随着分离电压增大，毛细管电色谱柱内焦耳热效应增加，当施加的分离电压太大时，容易导致基线不稳．综合考虑分离电压对分离度、迁移时间和稳定性的影响，实验选择－8 kV作为分离电压．

2．2．3 反压阀压力的影响

不同反压阀压力(p反压阀=1．8～7．2 MPa)时四种苷类药物的分离效果如图5所示，图中:0为甲苯;1为连翘苷;2为豆腐果苷;3为紫丁香苷;4为天麻素．随着反压阀压力增大，分析物迁移时间明显缩短，信噪比提高，表明毛细管电色谱中反压阀压力能够有效提高流动相的线速度，缩短分析物迁移时间，同时抑制气泡的形成，提高实验的重现性．随着反压阀压力的增加，豆腐果苷和紫丁香苷迁移速度增大，分离度有所降低．综合考虑分析物的迁移时间和分离度，反压阀压力选择为5．4 MPa．

2．2．4 缓冲液pH值和浓度的影响

缓冲溶液pH值影响待分离物质的电荷和电渗流，是影响分离的重要参数之一．连翘苷、豆腐果苷、紫丁香苷和天麻素四种苷类药物解离小，pH值变化对其在整体柱上的分配行为影响不大，但对电渗流大小具有一定的影响．实验表明，随着pH值的增加(3．0～7．0)，poly(POSS－MA－co－HEMA)有机硅胶杂化整体柱能够吸附流动相中磷酸根离子而使得电渗流增大［11］，连翘苷、豆腐果苷、紫丁香苷和天麻素的迁移时间逐渐缩短，综合考虑分析速度和分离效率，实验采用pH=7．0的缓冲液．

同时，实验考察了分析物在TEAP缓冲液浓度2～12 mmol·L－1范围内的分离情况．研究表明，盐浓度越小，离子强度越小，电渗流越大，有利于待测物质的迁移;但由于流动相极性越小，极性强的苷类药物在poly(POSS－MA－co－HEMA)有机硅胶杂化整体柱上的保留增强．以上两种作用效果相反，导致TEAP浓度对分析物的迁移时间总体影响不大．鉴于盐浓度越小，毛细管色谱柱内产生的焦耳热越小，毛细管电色谱基线和分离就越稳定，实验中缓冲液浓度选择为2 mmol·L－1．

图3 φACN对苷类药物分离的影响Fig．3 Effects of ACN content on the separations of glycosides

图4 U分离对苷类药物分离的影响Fig．4 Effects of voltage on the separations of glycosides

图5 p反压阀对苷类药物分离的影响Fig．5 Effects of supplement pressure on the separations of glycosides

2．3 线性范围及检出限

准确配制一系列不同浓度的四种苷类药物的标准溶液，在最优化条件下进行CEC分析测定，每个浓度平行测定3次，以峰面积(A)对样品浓度(ρ)进行线性回归计算，得到的回归方程、线性范围、相关系数及检出限(S/N=3)列于表1．

在最优化条件下进行精密度试验，测得四种分析物迁移时间和峰面积的日内相对标准偏差(RSD)范围分别为0．4% ～0．7%和0．8% ～1．8%，日间相对标准偏差(RSD)范围分别为0．6% ～1．1%和1．3% ～3．3%，方法稳定，重现性良好．

表1 线性回归方程、线性范围、线性相关系数及检出限Tab．1 Regression equation，linear range，correlation coefficient and detection limit

2．4 模拟样品分析

参照1．3节处理方法向血清样品中分别加入质量浓度为15μg·mL－1连翘苷、50 μg·mL－1豆腐果苷、20μg·mL－1紫丁香苷和80μg·mL－1天麻素的混合标准溶液，乙腈提取后，经亲水作用毛细管电色谱分析，实验结果列于表2，四种苷类药物的平均回收率范围在95．6% ～99．1%，RSD≤3．3%，该方法用于血清中苷类药物成分分析，结果良好．

表2 四种苷类药物在血清中测定回收率及精密度Tab．2 Recoveries and precision of four glycosides added in serum

3 结语

研究连翘苷、豆腐果苷、紫丁香苷和天麻素4种苷类药物在poly(POSS－MA－co－HEMA)有机硅胶杂化整体柱上的亲水作用电色谱行为，优化建立了苷类药物的亲水作用毛细管电色谱检测技术，在10 min内实现了4种苷类药物的基线分离．连翘苷、豆腐果苷、紫丁香苷和天麻素线性范围分别为10～200、25～200、15～200和25～200μg·mL－1，检测限为1．5～8．0μg·mL－1．应用于血清模拟样品分析，平均回收率为95．6% ～99．1%，相对标准偏差小于3．3%，该方法在强极性药物成分及血液中药物组分的电色谱行为研究和高效分离方面具有良好的可行性．