白细胞介素2和6对肝癌细胞表达血管内皮生长因子D的调节

白细胞介素2和6对肝癌细胞表达血管内皮生长因子D的调节

孙超唐瑞峰白建国田贵金苑建磊齐帅

(河北医科大学第四医院肝胆外科，河北石家庄050011)

摘要〔〕目的探讨白细胞介素(IL)-2和IL-6对肝癌细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)-D的调节。方法采用由IL-2或IL-6分别对肝癌细胞株SMMC-7721和BEL-7402进行刺激，采取逆转录-聚合酶链式反应技术(RT-PCR)观察其VEGF-D基因表达。结果IL-2使细胞株SMMC-7721和BEL-7402产生VEGF-D mRNA减少；IL-6对肝癌细胞株BEL-7402 VEGF-D mRNA表达存在促进效果，但是无法从作用时间上来显著判断。IL-6对肝癌细胞株SMML-7721 VEGF-D mRNA表达存在促进效果，当浓度条件满足情况下，促进作用和作用时间存在正相关。结论抑制肝癌细胞VEGF-D mRNA的表达方面，IL-2作用比较明显，对肝癌淋巴转移能够形成一定作用；肝癌细胞BEL-7402和SMML-7721 VEGF-D mRNA的表达方面，IL-6带来的促进效果明显，但是对肝癌作用需更多研究。

关键词〔〕肝癌；白细胞介素2；白细胞介素6；血管内皮生长因子D；逆转录-聚合酶链式反应

中图分类号〔〕R735.7〔文献标识码〕A〔

项目基金

通讯作者：唐瑞峰(1965-)，男，主任医师，教授，博士，硕士生导师，主要从事肝胆疾病研究。

第一作者：孙超(1983-)，男，主治医师，硕士，主要从事肝胆疾病研究。

原发性肝癌临床症状出现晚，通过手术的方式来切除的可能性很低，且预后情况不良。癌细胞的活跃性与血管内皮生长因子(VEGF)家族之间存在紧密的关系。作为VEGF家族的一员，VEGF-D体内表达分两种：一是正常表达，二是肿瘤细胞的异常表达，与肿瘤侵袭、转移形成密切关系。细胞因子对VEGF家族成员表达形成影响，而常见的炎性介质白细胞介素(IL)-2、IL-6作用较明显。本研究探讨IL-2和IL-6对肝癌细胞株VEGF-D基因表达的调节，分析肝癌细胞的侵袭和转移效应。

1材料与方法

1.1细胞培养、刺激、分组及总RNA的提取细胞培养：无菌、37℃，湿度为含5%CO2的饱和状态；培养基RPMI1640，第一阶段要求内部AMV逆转录酶+逆转录反应物，温度42℃，时长60 min；第二阶段是将cDNA 2 μl+PCR反应物+VEGF-D正反义引物，剂量均为2.5 μl，总反应体系为20 μl，SMMC-7721和BEL-7402。刺激：①人肝癌细胞株复苏-传代-稳定对数生长，将10%胎牛血清更换成0.1%胎牛血清，型号不变，持续培养12 h，主要目的是避免血清与细胞增殖之间的不良作用。分组：刺激12 h后，培养液继续调整作为分组依据，实验组分两种培养液，一是0.1、1、10、100、200 μg/L的IL-2 0.1%胎牛血清，二是0.1、1、10、100、200 μg/L的IL-6 0.1%胎牛血清。培养3、6、12、24 h。对照组：刺激后，实验组中的两种培养液添加磷酸钠盐缓冲液(PBS)，要求剂量一致。总RNA的提取：定时获得细胞，刺激方法是Trizol一步法，总RNA提取包括刺激前后两个时间段。

1.2逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)反应材料：第一阶段，RNA 2 μl+AMV逆转录酶+逆转录反应物，温度控制在42℃，时长控制在60 min；第二阶段是将cDNA 2 μl+PCR反应物+VEGF-D正反义引物，剂量2.5 μl，总反应体系为20 μl，先温度控制在95℃，实现预变性5min，再控制温度为94℃，变性45 s，55℃退火45 s，72℃持续1 min 30 s，循环40次，再控制温度72℃反应时长为5 min；而针对cDNA 2 μl+PCR反应物+β-actin正反义引物，剂量2.5 μl，总反应体系为20 μl：先温度控制在95℃，实现预变性5 min，再控制温度为94℃，变性30 s，55℃退火30 s，72℃持续30 s，循环35次，再控制温度72℃反应时长为5 min；PCR技术应用于扩增循环数的确定。产物先后需要电泳、染色，再进行扫描(凝胶型)分析，其中电泳使用1.5%普通琼脂糖凝胶、染色采取溴乙啶，实现DNA电泳条带扫描和光量子强度处理，将VEGF-D与β-actin比值作为表达水平的参照，对VEGF-D产物相对定量。VEGF-D上游引物：5' AGC TGG GGA AGA GTA CCA ACA 3'，下游引物：5' CAC AGA GAG CTG GTT CCT GGA 3'，对应生成一个422个碱基的基因片段。β-actin上游引物：5' TGA GAC CTT CAA CAC CCC AG 3'，下游引物：5' GCC ATC TCT TGC TCG AAG TC 3'，对应生成一个316个碱基的基因片段。

1.3统计学方法应用SPSS13.0统计软件进行t检验。

2结果

IL-2抑制肝癌细胞株BEL-7402 VEGF-D mRNA的表达，浓度及作用时间不存在相关性。见图1。IL-2抑制肝癌细胞株SMML-7721 VEGF-D mRNA的表达，并在0.1～100 μg/L范围内随浓度的增加，抑制作用逐步增强，但与作用时间不存在相关性。见图2。IL-6与肝癌细胞株BEL-7402 VEGF-D mRNA表达存在促进效果，但与作用时间不存在显著相关。见图3。IL-6与肝癌细胞株SMML-7721 VEGF-D mRNA表达存在促进效果，当浓度条件满足情况下，促进作用和作用时间存在正相关。见图4。

1.对照组;2.0.1 μg/L;3.1 μg/L;4.10 μg/L;5.100 μg/L;6.200 μg/L；下图同 图1　IL-2对肝癌细胞SMMC-7402表达 VEGF-D mRNA的影响

图2　IL-2对肝癌细胞BEL-7721表达 VEGF-D mRNA的影响

图3　IL-6对肝癌细胞SMMC-7402表达 VEGF-D mRNA的影响

图4　IL-6对肝癌细胞BEL-7721表达 VEGF-D mRNA的影响

3讨论

原发性肝癌转移能力很强，主要是肝内转移为主。人VEGF-D在淋巴管内皮细胞增生方面产生的促进效果表现出了特异性，如淋巴管新生和淋巴转移方面均存在相关性。研究〔1，2〕表明，VEGF-D与肝癌及胰腺癌表达之间存在明显的相关性，对于这些肿瘤的侵袭和转移等表现出来的生物学行为存在相关性。IL-2可抑制胰腺癌淋巴转移，主要限制胰腺癌细胞VEGF-D mRNA表达，而IL-6对于某些胰腺癌细胞VEGF-D mRNA表达也有促进效果。

“细胞因子对于恶性肿瘤的进一步发展”的研究证明部分细胞因子是能够产生重要效果的〔3，4〕。此类细胞因子表现出来的介质作用对癌细胞和基质细胞形成一个相互作用的机制，这种作用机制下，出现癌细胞侵袭和转移到身体其他部位，如淋巴等产生的影响作用很重要。缺氧，K-ras、p53基因的突变、VHL基因产物、生长因子如成纤维细胞生长因子(FGF)-2和转化生长因子(TGF)-B、转录因子如缺氧诱导因子(HIF)-1α和sp1等这些细胞因子和生长因子都可以产生诱导效果。而新生血管的形成方面，细胞因子IL-1、IL-6等通过对上述家族的表达诱导，是可以产生这种效果的〔5～7〕。Salven 等〔8〕证实：IL-1α对炎症细胞的诱导，能够在VEGF-A实现血管新生；Cohen等〔9〕证实：IL-6对肿瘤细胞株可在刺激状况下，形成VEGF-A；Huang等〔10〕证实：IL-6在胃癌VEGF-A的表达，会导致产生癌组织新生血管；Wei等〔11〕证实：IL-6激活VEGF-A能够促进颈部肿瘤的新生血管生长。唐瑞峰等〔12〕证实：IL-1α和IL-6因诱导促进 VEGF-A和C产生，作为一种调节因子作用于胰腺癌细胞。

IL-2在免疫治疗或肿瘤生物治疗方面已经得到重视和具有广泛的使用率〔13〕。报道〔14，15〕显示，IL-2受体在肿瘤细胞表面上具有明显的相互关系，这种相互结合(IL-2与受体)的情况下，限制肿瘤细胞继续发展。本研究表明IL-2对肝癌细胞的增殖可以产生明显的限制效果，甚至可以实现对肝癌细胞在形成VEGF-D方面来实现抑制作用。

IL-6的功能开发已经得到了非常广泛的程度〔16〕，表现出来的生物活性作为关键因子，在机体细胞因子中占据了重要地位，表现最活跃的是在造血系统、免疫应答及炎症反应方面。该因子的特性是不仅直接对肿瘤细胞进行作用，还可以对周边细胞因子网络的生存环境进行改变，进而间接作用于肿瘤细胞，同时，肿瘤细胞生长的刺激或抑制作用方面，IL-6都表现出明显的双面性效果，分析其原因是IL-6跟靶细胞特性相关联。Strassmann等〔17〕研究显示，IL-6在促进肿瘤病情恶化方面，是通过肿瘤恶病质状态调节来产生的。IL-6也与肿瘤抗体的免疫情况有关，也表现出了肿瘤细胞的表达相关性很显著。IL-6水平与肿瘤临床分期有关，随着分期的时间推移，肿瘤的负荷程度就越大，IL-6水平与之呈正相关，从肿瘤病情来说，存在远处转移的晚期病患血清IL-6水平表现出很高的水平，而无转移病患则很低；治疗效果与血清IL-6水平呈负相关。本研究中IL-6的促进效果表明，该因子能够让肝癌细胞形成VEGF-D，并引发肝癌淋巴转移。抑制肝癌细胞VEGF-D mRNA的表达方面，IL-2作用比较明显，对肝癌淋巴转移能够形成一定作用。肝癌细胞BEL-7402和SMML-7721 VEGF-D mRNA的表达方面，IL-6带来的促进效果明显，但是对肝癌作用需更多研究。

4参考文献

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〔2014-07-19修回〕

(编辑苑云杰)