α-硫辛酸对大鼠急性胰腺炎相关肾损伤的保护作用

α-硫辛酸对大鼠急性胰腺炎相关肾损伤的保护作用

赵丽梅冯志杰高军萍孙泽明宋梅

(河北医科大学第二医院消化内科，河北石家庄050000)

摘要〔〕目的探讨α-硫辛酸(ALA)对急性胰腺炎(AP)大鼠肾脏细胞间黏附分子(ICAM)-1与血管细胞间黏附分子(VCAM)-1表达水平的影响及其在氧化应激损伤中的保护作用及机制。方法采用3.5%牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射制备AP大鼠模型，将雄性Wistar大鼠72只。随机分为3组，假手术组(SO组,n=24)、AP组(n=24)、ALA治疗组(ALA组,n=24)，于造模后腹腔内注射ALA(1 mg/kg)，各组以不同时间点3 h、6 h、12 h分为3个亚组，每个亚组为8只大鼠。采用生化法测定血清的淀粉酶及肾功能肌酐(Cr)与尿素氮(BUN)水平；硫代巴比妥酸法检测肾组织匀浆中丙二醛(MDA)含量、黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力；应用HE染色观察肾脏组织病理学变化，免疫组织化学(SP)法检测肾组织中ICAM-1、VCAM-1蛋白的表达。结果在AP组各时间点血清淀粉酶、Cr、BUN及肾组织中MDA含量均较SO组显著升高，而肾组织的SOD活力则明显降低，光镜下HE染色可见肾近曲小管上皮细胞变性、坏死，肾小球淤血，肾间质内大量炎性细胞浸润。免疫组化法染色后观察在SO组肾组织中几乎没有ICAM-1与VCAM-1的表达，而在AP组中则有较强的表达。与AP组相比，在ALA组血清淀粉酶、Cr、BUN及肾组织MDA含量较AP模型组明显降低，SOD活力则明显升高，给予ALA治疗后组织损伤明显改善，仅有肾小管上皮细胞轻度水肿，炎性细胞浸润已不明显，ICAM-1与VCAM-1表达明显减弱。结论AP大鼠存在肾脏氧化应激损伤和肾脏炎性细胞因子的激活，ALA可以通过其抗氧化作用以及抑制炎性细胞因子ICAM-1与VCAM-1的表达对大鼠AP相关肾损伤发挥保护作用。

关键词〔〕α-硫辛酸；急性胰腺炎；肾损伤

中图分类号〔〕R576〔

基金项目：河北省医学科学研究重点课题计划基金(No.20110089)

通讯作者：冯志杰(1963-)，男，教授，主任医师，主要从事消化内科疾病研究。

第一作者：赵丽梅(1976-)，女，主管检验师，硕士，主要从事消化内科疾病研究。

急性胰腺炎(AP)是临床常见的急腹症之一，近年来发病率明显增多，尽管大部分的胰腺炎表现为轻度，但据文献统计约22.5%的病人会发生全身炎症反应综合征(SIRS)，继之发展为多器官障碍综合征(MODS)，成为重症急性胰腺炎(SAP)，其病情凶险，并发症涉及全身各脏器〔1〕。研究显示SAP伴急性肾损伤(AKI)病人发生MODS的概率很高(88.1%)而且发展至急性肾衰竭(ARF)后病死率高达80%，出现ARF后其他脏器衰竭发生率也明显上升〔2，3〕，因此，早期预防、治疗AP患者的肾损伤具有重要临床意义。围绕AP相关肾损伤的机制有着众多的研究，其中炎性介质、细胞因子以及氧自由基的作用是目前研究的热点。本文通过建立AP肾损伤的模型并给予抗氧化剂α-硫辛酸(ALA)作为治疗，通过检测肾功能、肾脏病理学，细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞间黏附分子-1(VCAM-1)在肾组织中的蛋白表达及丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)等氧化应激指标，以探讨ALA对AP相关肾损伤的保护作用及机制。

1材料与方法

1.1实验动物72只清洁级成年健康雄性Wistar大鼠，体重(250±25)g，由河北医科大学实验动物中心提供。全部动物均在同一实验室按清洁级大鼠要求专人饲养，自由进食水。实验过程符合中华人民共和国的《实验动物管理条例》及伦理要求。

1.2主要试剂MDA及SOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所；多克隆兔抗ICAM-1抗体、多克隆兔抗VCAM-1抗体、免疫组织化学SP试剂盒以及DAB显色剂均购自武汉博士德生物技术公司；牛磺胆酸钠与ALA均购自美国Sigma公司。

1.3动物模型建立采用3.5%牛磺胆酸钠0.1 ml/kg逆行胰胆管注射建立雄性SD大鼠AP模型。具体操作方法如下：选取清洁健康雄性Wistar大鼠，准确称质量，标记，随机分组。大鼠实验前24 h开始禁食，自由饮水。10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔内注射麻醉，取仰卧位，将动物四肢及头固定于操作台上，备皮、消毒、铺无菌洞巾，于上腹正中作2 cm切口进入腹腔，显露胰胆管，在近肝门处用无创血管夹夹闭胰胆管后，用4号加工钝头头皮静脉针于十二指肠乳头附近逆行插入胰胆管，以0.2 ml/min速度注入3.5%牛磺胆酸钠(0.1 ml/100 g)，推药后用无创血管夹夹住胰胆管入十二指肠处，观察10 min，去除血管夹，关腹，经胰腺病理学证实AP造模成功。

1.4实验分组将72只大鼠随机分成3组，每组24只，各组又随机分为3、6、12 h时间点3个亚组，每亚组为8只大鼠。①假手术组(SO组)：开腹翻动十二指肠并触摸胰腺3次。②AP组：制造AP模型组。③ALA组：制造AP模型成功后，于腹腔内注射ALA(1 mg/kg)。

1.5取材分别于3 h、6 h、12 h处死各组大鼠取材，下腔静脉穿刺抽取全血2 ml用于测定血淀粉酶、肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)等生化指标；取胰腺组织及楔形肾组织块，一部分以10%甲醛固定，用于HE染色及免疫组织化学检测。另一部分用PBS液浸润(1∶9)后，用组织匀浆器冰浴下制成组织匀浆，4℃离心2 000 r/min 30 min，取上清液-70°保存，进行肾组织SOD、MDA及蛋白定量检测。胰腺组织只作光镜检查，证实AP制模成功。

1.6检测指标①肾组织MDA及SOD含量测定：用硫代巴比妥酸分光光度比色法测定肾组织MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD含量，按照说明书操作方法测定。②胰腺及肾组织HE染色：常规石蜡包埋，4 μm厚度连续切片，行HE常规染色，光镜下观察胰腺和肾脏组织病理变化。③免疫组织化学检测肾组织中ICAM-1及VCAM-1表达：按照SP试剂盒操作说明书进行。石蜡切片常规脱蜡、梯度酒精水化，柠檬酸盐缓冲液微波修复，凉至室温，经3% H2O2常温孵育15min消除内源性过氧化物酶，再加入一抗ICAM-1抗体(PBS稀释成1∶100)，4℃冰箱过夜，再分别加二抗和辣根过氧化物酶标记的三抗链霉卵白素，37℃孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，常规脱水透明，中性树脂封片。阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采用PBS代替一抗为标准。每例标本镜下400倍随机选取10个视野，采集图像，应用 Image pro plus 6.0专业图像分析软件进行测量，以阳性细胞染色的平均光密度值(OD值)来表示抗原的相对表达量。

2结果

2.1各组大鼠血清淀粉酶的变化在3、6和12 h各时间点，SO组无明显变化。与SO组比较，在AP组和ALA组均显著升高(P<0.01)，且随时间点的延长，血清淀粉酶逐渐升高。而ALA组较AP比较血清淀粉酶则明显降低(P<0.05)。见表1。

表1　AP大鼠血清淀粉酶、Cr、BUN水平以及肾组织SOD活力、MDA含量测定

与SO组比较：1)P<0.05，与AP组比较：2)P<0.05，与同组3 h比较：3)P<0.05，与同组6 h比较：4)P<0.05

2.2各组大鼠肾功能的变化血清Cr与BUN在3、6和12 h各时间点，SO组无明显变化。与SO组比较，急AP组和ALA组均显著升高(P<0.01)，且随时间的延长Cr、BUN升高更为明显。与AP组比较，ALA组血清Cr、BUN水平显著降低(P<0.05)。见表1。

2.3肾组织MDA、SOD含量的变化与SO组相比，AP组大鼠肾脏的脂质过氧化程度增高；在6 h和12 h AP组肾组织脂质过氧化产物MDA水平明显高于SO组(P<0.01)；SOD活力则明显低于SO组(P<0.01)；而在3 h时肾组织中各组之间MDA与SOD无差异(P>0.05)；给予ALA治疗后大鼠肾脏的脂质过氧化的产物MDA较同时段AP组降低(P<0.05)，SOD增加，(P<0.05)。见表1。

2.4镜下肾脏组织病理学变化SO组大鼠肾皮质髓质结构清晰，肾小球和肾小管及间质的结构均正常，各个时间点无明显差别；AP组术后3 h肾小球和肾小管结构无明显改变，肾间质可见少量中性粒细胞浸润；6 h肾小球可见轻度淤血，肾小管上皮细胞呈明显水样变性，胞质疏松淡染，肾间质中性粒细胞浸润增加，随着时间的延长，肾脏组织损伤逐渐加重，肾近曲小管上皮细胞变性、坏死，肾小球淤血，肾间质大量炎性细胞浸润，而ALA组仅少数上皮细胞轻度水肿，细胞界限不清，胞质内有淡粉红色颗粒。见图1。

2.5肾组织ICAM-1与VCAM-1蛋白免疫组织化学检测ICAM-1与VCAM-1阳性表达定位于细胞质内，为棕黄色染色，高倍镜下观察呈细颗粒状。见图2，图3。在SO组，肾组织中

SO组6 h　　　　　AP组6 h　　　　ALA治疗组12 h 图1　AP大鼠肾组织的病理学变化(HE，×200)

AP组3 h　　　　　　AP组12 h　　　　ALA治疗组12 h 图2　AP大鼠肾组织的ICAM-1表达(DAB,×400)

AP组6 h　　　　　　AP组12 h　　　　ALA治疗组 图3　AP大鼠肾组织的VCAM-1表达(SP,×400)

几乎没有ICAM-1、VCAM-1表达。AP组大鼠术后3 h ICAM-1已可见少量表达(OD值：SO组vs AP组0.07±0.00 vs 0.08±0.02)，但与SO组相比无明显差异(P>0.05)。随着时间的推移，AP组6 h与12 h检测发现ICAM-1表达均明显增加，与SO组相比其阳性细胞数明显增多(SO组vs AP组0.05±0.00 vs 0.17±0.01；0.05±0.01 vs 0.24±0.03)(P<0.01)；ALA组同样在3、6、12 h均可见到ICAM-1的表达，但与AP组相比，表达为明显减弱(P<0.05)。VCAM-1的表达则出现在AP组与ALA组的6 h与12 h，且在12 h有明显表达，与SO组相比有显著差异(P<0.01)；与AP组相比，ALA组VCAM-1的表达呈弱阳性，两组之间有显著差异(P<0.05)。

3讨论

AP发生后机体发生了一系列的病理变化，其中SIRS、氧化应激、内毒素血症、微循环障碍导致全身及肾血流动力学改变等均对肾脏功能产生一定的影响〔4〕。AP时胰腺组织缺血，局部微循环紊乱，毛细血管损伤所致的胰腺血管通透性增加，缺血组织中的吞噬细胞特别是中性粒细胞聚集后产生大量的氧自由基(OFR)并激发自由基的连锁增殖反应，导致机体内MDA含量升高，而SOD活性降低，过多的自由基可直接损伤肾小球毛细血管内皮细胞，使肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞变性、坏死，最终肾小球滤过率下降导致急性肾衰竭〔5〕；同时氧自由基还可激活核因子-κB信号传导通路，造成细胞因子、黏附分子等过度表达〔6〕。从而介导胰腺和胰外器官血管内皮损伤、微循环障碍和血管通透性增加，引起胰腺和全身器官的功能损伤。研究总结发现肾功能损害仅次于肺损伤，且与胰腺炎的预后密切相关〔7〕。Telek等〔8〕研究显示SAP肾损伤时肾组织的SOD和MDA与SAP肾损伤呈正相关，因此认为OFR引发的脂质过氧化反应是SAP肾损伤重要因素。ICAM-1及VCAM-1属于免疫球蛋白超家族成员，通过识别其受体白细胞功能相关抗原-1(LFA-1)与白细胞表面配体VLA-4等可促进白细胞与血管内皮细胞的黏附及渗出，扩大炎症反应，造成血管病变，导致组织器官发生病理生理改变而促进炎症和免疫反应。病理情况下，它们可在病变的肾小管上皮细胞上强烈表达，为肾脏炎症活动的主要标志。研究发现ICAM-1及VCAM-1是诱导炎性细胞向肾间质组织浸润的主要黏附分子〔9～11〕。黏附分子在肾脏免疫性炎性损伤时，介导了单核/巨噬细胞等炎细胞在血管壁的黏附，继而穿过血管壁向炎症区域移行、聚集，导致和促进组织损伤。炎性细胞在肾组织的持续浸润是肾脏炎症反应扩大和肾功能损害的重要因素，这些炎症因子在急性肾损伤时明显增加,同时加重对肾小球内皮细胞和系膜细胞损伤作用〔12，13〕。国外研究发现，病理情况下，ICAM-1可在病变的肾小管上皮细胞上强烈表达，为肾脏炎症活动的主要标志。肾缺血/再灌注损伤时，ICAM-1表达上调，导致循环白细胞在局部黏附，使内皮通透性增加，且浸润、激活的白细胞还可导致直接的组织损伤，ICAM-1缺陷大鼠能朋显减轻肾缺血/再灌注损伤，因此拮抗ICAM-1可减轻肾损伤〔14，15〕。总之在AP时，炎症反应和氧化应激相互影响，参与细胞损伤过程，致炎因子和氧化应激发挥协同作用，触发共同的信号转导通路，导致炎症的级联放大，从而导致肾脏功能的损伤。本实验结果显示造模组大鼠可见一般状况的改变，血肌酐、尿素氮明显升高，MDA增高和SOD下降，免疫组化结果显示ICAM-1与VCAM-1在AP造模组和治疗组表达明显增强，表明这两种黏附分子可能在氧化应激与炎症反应状态下被激活，进一步证实了它们在AP肾损伤发展过程中的作用，与国内外研究报道相符。

ALA为一种新型抗氧化剂，是类维生素物质，有很强抗氧化活性，和其还原态二氢硫辛酸(DHLA)一起被誉为“万能抗氧化剂”，是氧化应激的强效抑制剂，在临床可以用于预防和治疗多种疾病。在癌症、衰老、糖尿病(DM)、动脉粥样硬化、脑和神经组织的退化性等疾病中发挥着重要的作用，已受到国际生物医学界的高度关注。它兼有脂溶性与水溶性有特性，能被消化道轻易吸收，可以分布到机体的各个部位发挥作用。主要作用：①可以直接清除ROS；②螫合金属离子，降低DH的产生，阻断脂质过氧化；③再生(还原)其他的抗氧化剂〔16～21〕。Aitken等〔22〕研究发现抗氧化剂可以通过调控GPx、硫氧蛋白还原酶等的活力来抵制ICAM-1与VCAM-1在机体内的表达，从而缓解了炎症反应，减低了疾病的发生率与严重程度。代新华等〔23〕的研究则表明ALA能显著降低DM大鼠氧化应激水平，减轻氧化应激对肾组织的损伤及炎症反应而保护肾脏。

本实验表明ALA对AP相关性肾损伤具有保护作用，其机制可能与抗氧化作用和抑制肾组织中ICAM-1与VCAM-1的释放有关。

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〔2013-08-22修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)