宫颈鳞癌组织中血管生成拟态及HIF-1α的表达

黄小环，向丽，龚莉，周铁军

（1.泸州医学院附属医院病理科，四川泸州646000；2.泸州医学院病原生物学教研室，四川泸州646000）

宫颈鳞癌组织中血管生成拟态及HIF-1α的表达

黄小环1，向丽2，龚莉1，周铁军1

（1.泸州医学院附属医院病理科，四川泸州646000；2.泸州医学院病原生物学教研室，四川泸州646000）

目的研究宫颈鳞癌组织中是否存在血管生成拟态（VM），以及其与缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）与宫颈鳞癌发生发展浸润转移的关系和临床意义。方法收集2010年1月至2011年12月泸州医学院附属医院经病理证实为人宫颈鳞癌组织石蜡标本67例，进行CD34/过碘酸雪夫染色（PAS）双重染色检测是否存在VM；采用免疫组化检测HIF-1α在宫颈鳞癌组织中的表达，分析VM与HIF-1α的相关性及临床病理特征。另随机选择同期因子宫肌瘤行子宫全切手术的正常宫颈组织标本20例作为对照。结果宫颈鳞癌组织中VM和HIF-1α阳性率分别为38.81%（26/67）、64.18 %（43/67），显著高于正常宫颈组织[0（0/20）]，差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同病理分级、国际妇产科联盟（FIGO）分期及有无淋巴结转移患者宫颈鳞癌组织中VM阳性率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。不同肿瘤大小及有无淋巴结转移患者HIF-1α阳性率比较，差异也均有统计学意义（P＜0.05）。VM与HIF-1α呈正相关（r=0.339，P＜0.05）。结论宫颈鳞癌组织中存在VM、HIF-1α高表达可能促进VM的形成，可能共同促进宫颈鳞癌的浸润和转移。

宫颈肿瘤；癌，鳞状细胞；缺氧诱导因子1，α亚基；免疫组织化学；血管生成拟态

充足的血液供应是实体肿瘤生长、局部浸润和远处转移的前提。现有的研究表明，肿瘤的血液供应方式主要有血管生成、马赛克血管和血管生成拟态（VM）3种[1]。其中VM是一种新的肿瘤微循环模式，可以模拟内皮依赖性血管的形态结构，为肿瘤提供营养。在多种实体肿瘤中发现VM的存在，而且与预后相关，低氧环境有利于VM的形成。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是在缺氧微环境进行适应性反应的关键性转录调控因子，通过调节肿瘤细胞的物质代谢、细胞增殖、诱导肿瘤血管的形成，促进肿瘤的浸润和转移。本实验拟研究宫颈癌中是否存在VM，并通过免疫组化检测HIF-1α在宫颈鳞癌组织中的表达，研究二者与宫颈鳞癌发生发展、浸润转移的关系及临床意义。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料收集2010年1月至2011年12月泸州医学院附属医院手术切除经病理证实为宫颈鳞癌的组织标本67例。所有患者病历资料保存完整，均为首次发病，术前均未接受放、化疗。患者年龄24～65岁，平均（43.67±8.14）岁。依据国际妇产科联盟（FIGO，2000年）的临床分期：Ⅰ期36例，Ⅱ期31例；肿瘤大于4 cm 27例，肿瘤小于或等于4 cm 40例；按WHO组织学分类标准：角化型21例，非角化型46例；有淋巴结转移29例，无淋巴结转移38例。另随机选择同期因子宫肌瘤行子宫全切手术的20例健康宫颈组织标本作为对照。所有标本均经4%中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片。

1.1.2 主要试剂鼠抗人CD34单克隆抗体购于上海基因科技公司，兔抗人HIF-1α多克隆抗体购于美国Bioworld Technolog公司。Envision试剂盒购于Dako公司。过碘酸雪夫染色（PAS）染液按照《病理学技术》[2]自行配制。

1.2 方法

1.2.1 CD34/PAS双重染色将石蜡切片脱蜡至水，高压修复后3%过氧化氢（H2O2）消除内源性过氧化物酶，滴加CD34单克隆抗体（1∶100）孵育并过夜，严格按Envision二步法免疫组化试剂盒说明书操作，DAB显色后，按照PAS操作步骤进行，苏木素复染，梯度脱水后中性树胶封片。

1.2.2 免疫组化染色采用免疫组化Envision二步法，将石蜡切片脱蜡至水，高压修复后3%H2O2消除内源性过氧化物酶，滴加HIF-1α多克抗体（1∶100）孵育并过夜，滴加Envision二抗37℃孵育2 h，DAB显色，苏木素复染，梯度脱水后中性树胶封片。

1.2.3 免疫组化结果判断所有免疫组化染色结果均由2位病理医生在不知病例资料的情况下盲法阅片判断，对每张切片至少在高倍镜（400×）下观察10个不重复视野来判断结果。参照文献[2]标准采用半定量方法将染色强度分为4级进行评分：不着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。将阳性细胞的比例也分为4级进行评分：阳性细胞数小于10%为0分，10%～＜40%为1分，40%～＜70%为2分，≥70%为3分。2种评分相加，0～1分为（-），2分为（+），3～4分为（++），5～6分为（+++）。统计时（-）为阴性，其余为阳性。

1.2.4 VM判断每张切片光镜下随机选择10个无重叠视野进行观察计数，将CD34染色阳性的管腔判定为内皮血管；CD34染色阴性的管腔，并外附淡红色（PAS阳性）的细胞外基质，结合苏木素-伊红染色（HE染色）证实管壁为肿瘤细胞围成，判定为VM阳性。

1.3 统计学处理应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验，采用Spearman进行相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈鳞癌组织中是否存在VM通过HE染色显示，肿瘤细胞围成的管道样结构，部分管腔内可见红细胞，但未见肿瘤性坏死及炎症细胞。CD34/PAS双重染色显示，PAS阳性物质厚薄不一，形成管壁样结构，呈长条形、不规则形及环状，将肿瘤细胞和红细胞分开，管道样结构CD34染色未见阳性信号，提示没有内皮细胞。VM主要出现在少血管或无血管区域，在血管丰富区域未见VM。67例宫颈鳞癌组织标本中26例检测到VM，阳性率为38.81 %（26/67），20例健康宫颈组织中未见VM[0（0/20）]，二者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 宫颈鳞癌组织中HIF-1α表达HIF-1α主要表达在细胞质中，部分在细胞核。67例宫颈鳞癌组织中43例有阳性信号，阳性率为64.18%（43/67），20例健康宫颈组织中HIF-1α无表达[0（0/20）]，二者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 宫颈鳞癌组织中VM和HIF-1α的表达与临床病理特征的关系[n（%）]

2.3 宫颈鳞癌组织中VM和HIF-1α与临床病理特征的关系不同年龄、肿瘤大小患者宫颈鳞癌组织中VM阳性率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；但不同病理分级、FIGO分期及有无淋巴结转移患者宫颈鳞癌组织中VM阳性率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。不同年龄、病理分级和FIGO分期患者HIF-1α阳性率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；但不同肿瘤大小及有无淋巴结转移患者HIF-1α阳性率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.4 宫颈鳞癌组织中VM与HIF-1α的相关性宫颈鳞癌组织中VM阳性的标本中，HIF-1α阳性率为84.62%（22/26）；VM阴性的标本中，HIF-1α阳性率为51.22%（21/41），二者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。宫颈鳞癌组织中VM与HIF-1α呈正相关（r=0.339，P＜0.05）。见表2。

表2 宫颈鳞癌组织中VM与HIF-1α的相关性（n）

3 讨论

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率为12.96/10万[3]。随着宫颈脱落细胞学检查的运用，早期宫颈癌及癌前病变的检测率有所增加，但随着生活习惯和方式的改变，宫颈浸润癌的发病率有所提高且有年轻化趋势。宫颈鳞状细胞癌是宫颈癌最常见的组织学类型，预后较差。因此，研究宫颈鳞癌发生发展、浸润转移的机制，对临床治疗具有积极的意义。

诱导肿瘤血管的形成是肿瘤的固有特性。通过形成肿瘤血管，不但为肿瘤生长提供营养，同时，新生的肿瘤血管壁发育尚未完善，通过新生血管壁，肿瘤细胞易进入血管腔而发生浸润和转移[4]。传统认为，肿瘤的血液供应均是通过血管腔提供，但是Maniotis等[5]在对眼葡萄膜黑色素瘤的研究中发现，肿瘤组织内通过PAS可以见到粉红色物质，呈长条形、不规则形及环状，厚薄不一，形成管壁样通道，CD34、CD31等内皮细胞标记染色为阴性。血液在无内皮细胞的通道中运行，提出了VM这一特殊的血液供应方式。在对多种实体肿瘤，特别是高度恶性的实体肿瘤的观察中均发现了VM[6-8]。本研究结果显示，通过HE染色显示肿瘤细胞围成的管道样结构，部分管腔内见红细胞，但内未见肿瘤性坏死及炎症细胞；CD34/PAS双重染色显示，PAS阳性物质厚薄不一，形成管壁样结构，呈长条形、不规则形及环状，管道样结构CD34染色阴性。正常宫颈组织中没有见到PAS阳性结构。VM主要分布在少血管或无血管区域，在血管丰富区域未见到VM的形成。提示宫颈鳞癌组织中存在VM。宫颈鳞癌组织中VM与患者肿瘤大小、年龄无关，与FIGO分期、组织学分级及淋巴结转移有关，提示VM可作为判断预后的重要指标之一。

有研究表明，肿瘤微环境的改变在肿瘤浸润和转移过程中起着重要作用，而且也可能在VM的形成中起着重要作用，缺氧是其重要的组成成分之一[9-10]。肿瘤的生长需要持续供养，氧气在组织中以100～180 μm的速度缓慢扩散，远远不能满足肿瘤快速生长，导致肿瘤局部处于缺氧的状态[11]。HIF-1α是近年来发现的重要的缺氧标志物之一[12]。在缺氧状态下，HIF-1α被激活后可调节下游多种靶基因的转录，从而对维持肿瘤细胞的无氧代谢，促进新生血管生成，进而在促进肿瘤成活、生长和转移等起到重要作用[13]。本研究发现，HIF-1α在宫颈鳞癌组织中的阳性率为64.18%（43/67），与正常宫颈组织比较，差异有统计学意义（P＜0.05），且与患者年龄、组织分化和FIGO分期无关，与淋巴结是否转移、肿瘤大小有关，提示HIF-1α在宫颈鳞癌的发生发展、浸润和转移中起着重要作用。同时，通过相关分析显示，宫颈鳞癌组织中VM与HIF-1α呈正相关。其机制可能为肿瘤快速增长使肿瘤组织内血管供血不足，为缓解肿瘤组织缺氧状态，在内皮依赖性血管长入之前，需要一种替代途径，表现为VM的形成。因此，作者推测HIF-1α在VM的形成过程中起着一定作用。

综上所述，宫颈鳞癌组织中存在VM，HIF-1α的高表达可能有利于VM的形成。因此，联合检测宫颈癌组织中VM和HIF-1α对判断宫颈癌发生发展及预后具有重要意义。同时也为开辟肿瘤新的治疗途径提供理论依据。

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Vasculogenic mimicry in cervical squamous cell carcinoma tissues and the expression of HIF-1α

Huang Xiaohuan1，Xiang Li2，Gong Li1，Zhou Tiejun1
（1.Department of Pathology，the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou，Sichuan646000，China；2.Department of Pathogen Biology，Luzhou Medical College，Luzhou，Sichuan 646000，China）

ObjectiveTo study whether the vasculogenic mimicry in cervical squamous cell carcinoma tissues exists，as well as its relationship and clinic pathological parameters between hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α）protein and invasion and metastasis of progress of cervical squamous cell carcinoma.MethodsA total of 67 cervical squamous cell carcinoma resection specimens confirmed by pathology from January 2010 to December 2011 in the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College were collected and detected whether it existed VM by CD34/PAS dual immunohistochemical staining.It adopted immunohistochemical staining to detect the expression of HIF-1α protein in cervical squamous cell carcinoma tissues and analyze the association between VM and HIF-1α，as well as its clinic pathological characters.In addition，it selected 20 normal cervical tissues specimens underwent total hysterectomy for uterine fibroid as the control group.ResultsIn the cervical squamous cell carcinoma tissues，the positive expression rate of VM and HIF-1α was respectively 38.81%（26/67），64.18%（43/67），which was distinctively higher than that in the normal cervical tissues[0（0/20）].The difference had statistical significance（P＜0.05）；The formation of VM was associated with the FIGO staging，histology grading and lymphatic metastasis.The difference had statistical significance（P＜0.05）. The positive expression of HIF-1α protein was associated with lymphatic metastasis and cancer size，which was statistically significant in difference（P＜0.05）.There was a positive association between the expression of HIF-1α and VM（r=0.339，P＜0.05）.ConclusionVM exists in cervical squamous cell carcinoma tissues.Overexpression of HIF-1α may induce the formation of VM. VM and jointly promote the invasion and metastasis of cervical squamous carcinoma.

Uterine cervical neoplasms；Carcinoma，squamous cell；Hypoxia-inducible factor 1，alpha subunit；Immunohistochemistry；Vasculogenic mimicry

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.05.003

:A

:1009-5519（2015）05-0645-03

2014-11-19）

四川省教育厅科研基金资助项目（10ZB117）。

黄小环（1984-），女，重庆云阳人，硕士研究生，主要从事肿瘤病理学研究；E-mail：305549419i@qq.com。

周铁军（E-mail：tiejunzh502@163.com）。