O-羧甲基壳聚糖的制备工艺研究

孙萍，黄国清，韩晓娜，肖军霞

（青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛266109）

O-羧甲基壳聚糖的制备工艺研究

孙萍，黄国清，韩晓娜，肖军霞*

（青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛266109）

O-羧甲基壳聚糖（OCC）是壳聚糖的一种重要的衍生物，具有良好的水溶性、胶凝性和生物相容性。采用氯乙酸法制备OCC，研究了氯乙酸和氢氧化钾（KOH）的用量以及反应温度、反应时间对OCC取代度的影响，并采用红外光谱分析了羧甲基的取代位置。结果表明，当壳聚糖：氯乙酸：KOH的质量比为2∶2.5∶2.7时，在50℃下分批加入氯乙酸，搅拌反应4 h，得到的OCC的取代度较高为0.78，而且红外光谱分析表明所制备的羧甲基壳聚糖即为O-羧甲基壳聚糖。

O-羧甲基壳聚糖；取代度；红外光谱

壳聚糖是自然界唯一一种带正电的碱性多糖，具有安全性、生物相容性、黏膜结合性、成膜性及胶凝性等性质，已广泛应用于纺织、印染、造纸、食品、医药和环保等领域[1]。但壳聚糖只能溶于酸性溶液，这极大地限制了其应用范围[2]。羧甲基壳聚糖是壳聚糖经羧甲基化反应后的一类壳聚糖衍生物，根据羧甲基取代位置的不同可将羧甲基化产物分为O-羧甲基壳聚糖（O-carboxymethyl chitosan，OCC）、N-羧甲基壳聚糖和N，O-羧甲基壳聚糖。羧甲基在壳聚糖不仅具有良好的水溶性，还具备壳聚糖的优良性质，因此其应用范围较壳聚糖更广泛。

羧甲基壳聚糖可以用作水处理的絮凝剂、果蔬保鲜剂，还可以形成凝胶及微胶囊用作食品功能成分和药物的载体[3]，羧甲基壳聚糖中羧甲基的取代度与其性能有着密切的联系，因此制备不同取代度的羧甲基壳聚糖是目前研究的热点。陈凌云等[4]研究了羧甲基壳聚糖的取代度对其保湿性能的影响，发现羧甲基壳聚糖的保湿性能随取代度的增高而增强；姚倩等[5]研究了取代度与抗氧化性能的关系，发现羧甲基壳聚糖的取代度越高其氧化还原能力越强；魏玉萍等[6]研究了取代度对废水中的Cu2+的螯合能力的影响，结果表明羧甲基壳聚糖对废水中Cu2+的螯合能力随着取代度的增大而增强；同时研究发现羧甲基壳聚糖的取代度对果汁的澄清效果有一定影响[7]。

目前取代度对羧甲基壳聚糖形成水凝胶的溶胀性影响还未见报道，本文通过研究氯乙酸用量和氢氧化钾（KOH）的用量以及反应温度、反应时间对OCC取代度的影响，探索制备不同取代度的OCC的条件，进而为不同取代度的O-羧甲基壳聚糖水凝胶的溶胀及释放性能的研究提供技术参数。

1 仪器和材料

1.1 材料与试剂

壳聚糖（粘度500mPa·s，脱乙酰度95.2%）：潍坊海之源有限公司；95%乙醇（AR）：烟台三和化学试剂有限公司；盐酸（AR）、氢氧化钠（AR）：莱阳市康德化工有限公司；无水乙醇（AR）：天津市广成化学试剂有限公司；氯乙酸（AR）、异丙醇（AR）：天津市巴斯夫化工有限公司；溴化钾（AR）：天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

1.2 仪器与设备

双向定时恒温磁力搅拌器：上海沪西分析仪器厂有限公司；电子天平：上海奥豪斯公司；电热恒温水浴锅：龙口市先科仪器公司；DELTA320型pH计：梅特勒托利多有限公司；离心机：上海安亭科学仪器厂；电热鼓风干燥箱：上海福玛实验设备有限公司；傅立叶变换红外光谱仪：赛默飞世尔科学仪器部。

1.3 方法

1.3.1 OCC的制备

将壳聚糖浸于40mL异丙醇中，KOH溶于20mL的蒸馏水中，再将两者混合使壳聚糖浸泡3 h以上。在一定温度下，将氯乙酸分批加入其中，搅拌反应一定时间后，弃去异丙醇，将产物用蒸馏水完全溶解，将溶液的pH调至等电点处，再向溶液中加入乙醇析出沉淀，用95%乙醇洗涤沉淀，于60℃烘箱中干燥至恒重[8]。

1.3.2 OCC取代度的测定

采用电位滴定法测定。精确称取0.5 g羧甲基壳聚糖溶解于50m L的0.1mol/L的标准HCl溶液中，将其置于磁力搅拌器中完全溶解，用0.1mol/L标准NaOH溶液滴定，分别记下滴定至pH2.1和pH4.3时所消耗的NaOH体积[9]。计算公式如下：

式中：A为每克样品中NOCC的物质的量，mmol；W为样品重量，g；C为NaOH溶液浓度，（mol/L）；V1为滴定至pH2.1时所耗NaOH的体积，m L；V2为滴定至pH4.3时所耗NaOH的体积，mL。

1.3.3 红外光谱分析

将O-羧甲基壳聚糖干燥后，加入一定量的KBr进行研磨，取少量研磨好的粉末，压片后置于中红外光谱仪上在波长4 000 cm-1～400 cm-1范围内进行扫描分析，通过谱图分析官能团吸收峰的变化。

2 结果与分析

2.1 氯乙酸用量对OCC取代度的影响

取2 g壳聚糖分散于异丙醇中，将2.3 g KOH溶于20mL的蒸馏水中，将两者混合浸泡3 h以上，将与壳聚糖质量比为0.25∶1、0.5∶1、0.75∶1、1∶1、1.25∶1（即0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g）的氯乙酸分3次加入到浸泡充分的体系中，在室温下反应3 h后停止搅拌。氯乙酸用量对OCC的取代度的影响见图1。

图1 氯乙酸的用量对OCC取代度的影响Fig.1 Effect of chloroacetic acid dosage on the degrees of substitution of OCC

由图1可知，OCC的取代度随着氯乙酸用量的增大而增大，这可能是随着氯乙酸质量浓度的增大，壳聚糖的-OH容易与氯乙酸碰撞，发生羧甲基化反应的几率增加，并导致羧化度增加[10]，从而使OCC的取代度增大。当氯乙酸与壳聚糖的质量比为1.25∶1时，壳聚糖的羧甲基化程度最大，此时OCC的取代度最大为0.55。由于KOH和氯乙酸间的中和反应和水解反应过程都要放热，如果将氯乙酸一次全部加入，会发生强烈的副反应，从而使反应温度很难控制，同时氯乙酸利用率会降低，因此采用分次加入氯乙酸的方法，可有效的提高反应效率。

2.2 KOH的用量对OCC的取代度的影响

取2 g壳聚糖分散于异丙醇中，与壳聚糖质量比为0.95∶1、1.05∶1、1.15∶1、1.25∶1、1.35∶1（即1.9、2.1、2.3、2.5、2.7 g）的KOH溶于20m L的蒸馏水中，将两者混合浸泡3 h以上，在室温下搅拌反应，反应期间分3次加入1 g氯乙酸，每1 h加入一次，反应3 h后停止搅拌。KOH用量对OCC的取代度的影响见图2。

图2 KOH的用量对OCC取代度的影响Fig.2 Effect of KOH dosage on the degrees of substitution of OCC

由图2可知，OCC的取代度随着KOH质量浓度的增大而增大，这可能是由于在碱性条件下壳聚糖的活性基团-OH易发生羧甲基化反应，KOH浓度的增大可使壳聚糖结构单元中更多活性中心的形成，有利于壳聚糖与氯乙酸的反应[11]，从而使OCC的取代度增大。当KOH与壳聚糖的质量比为1.35∶1时，OCC的取代度达到最大为0.55。

2.3 反应温度对OCC的取代度的影响

取2 g壳聚糖分散于异丙醇中，2.3 g KOH溶于20mL的蒸馏水中，将两者混合浸泡3 h以上，分别在20、30、40、50、60℃下搅拌反应，反应期间分3次加入1 g氯乙酸，每1 h加入一次，反应3 h后停止搅拌。反应温度对OCC的取代度的影响见图3。

图3 温度对OCC取代度影响Fig.3 Effect of temperature on the degrees of substitution of OCC

由图3可知，OCC的取代度随着反应温度的升高先增大后减小，这可能是由于反应温度升高，羧甲基化反应的几率增加，从而使OCC的取代度升高；但是温度太高会加剧副反应的发生，不仅降低氯乙酸的利用率，增大产物在体系的溶解度，造成体系粘度上升，从而阻碍反应试剂的进一步扩散和渗透，还会使生成的OCC分子链断裂，而且体系中异丙醇也会大量蒸发，不利于反应进行[12]。当反应温度为50℃时，OCC的取代度最大为0.72。

2.4 反应时间对OCC取代度的影响

取2 g壳聚糖分散于异丙醇中，2.3 g KOH溶于20mL的蒸馏水中，将两者混合浸泡3 h以上，在常温下分别搅拌反应1、2、3、4、5 h，反应期间分3次加入1 g氯乙酸。反应时间对OCC取代度的影响见图4。

图4 反应时间对OCC取代度的影响Fig.4 Effect of reaction duration on the degrees of substitution of OCC

由图4可知，OCC的取代度随着反应时间的延长而增大，这可能是由于反应时间越长，壳聚糖的活性中心与氯乙酸碰撞几率越大，越容易发生羧甲基化反应，因此OCC的取代度越大。当反应时间为4 h时，OCC的取代度达到0.59，当反应时间为5 h时，OCC的取代度为0.60，说明搅拌反应4 h时壳聚糖已经基本完全发生羧甲基化，同时考虑成本等因素，选择搅拌时间为4 h。

2.5 OCC的红外光谱

取2 g壳聚糖分散于异丙醇中，2.7 g KOH溶于20mL的蒸馏水中，将两者混合浸泡3 h以上，在50℃下搅拌反应4 h，反应期间分3次加入2.5 g氯乙酸，此时制备得到的OCC的取代度为0.78。OCC的红外光谱见图5。

图5 OCC的红外光谱Fig.5 Infrared spectroscopy of OCC

由图5可知，对于壳聚糖[13]，在3 445.74 cm-1处的强吸收峰是-OH和-NH的特征吸收峰部分重叠结果；在1 152.84、1 083.04、1 664.51cm-1处产生了-O-、C-O和乙酰基中C=O的伸缩振动吸收峰；在893.48 cm-1处的吸收峰是伯胺-NH2的吸收带，伯胺N-H面内弯曲振动强吸收峰是1 599.46 cm-1。而对于OCC，1 652.70 cm-1是处较强的吸收峰是羧基上的C=O伸缩振动峰；并且在1 260.63 cm-1是-CH2-COOH中C-O伸缩振动和-OH面内弯曲振动偶合而产生的特征吸收，表明产物分子中含有羧甲基；1 434.55 cm-1处吸收峰为COO-的对称伸缩振动峰，1 071.31 cm-1处是C-O-C的强吸收峰，在此波长-OH的特征峰减弱，峰型变窄，说明壳聚糖在-OH上发生了羧甲基反应，羧甲基成功嫁接在壳聚糖上。3 418.76 cm-1和1 579.76 cm-1处的吸收峰为-NH的伸缩振动峰和弯曲振动峰，说明-NH2的吸收峰未消失，羧甲基取代并没有发生在氨基上，实验结果与文献一致[14]。

3 结论

采用氯乙酸法制备OCC，研究了氯乙酸和氢氧化钾的用量以及反应温度、反应时间对OCC取代度的影响，结果表明，当壳聚糖：氯乙酸：KOH的质量比为2∶2.5∶2.7时，在50℃下分批加入氯乙酸，搅拌反应4 h，得到的OCC的取代度最高达到了0.78。

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Research on the Preparation of O-carboxym ethyl Chitosan

SUN Ping，HUANG Guo-qing，HAN Xiao-na，XIAO Jun-xia*
（College of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，Shandong，China）

O-Carboxymethyl chitosan（OCC）is an important derivative of chitosan and possesses good water solubility，gelling capacity and biocompatibility.In this paper，OCC was prepared in the chloroacetic acid method and the effects of the dosages of chloroacetic acid and potassium hydroxide（KOH），temperature and time on the degrees of substitution of OCC were studied and the substitution reaction location was analyzed with infrared spectroscopy（FTIR）.The results showed that the optimum conditions for OCC preparation were：chitosan/chloroacetic acid/KOH ratio 2∶2.5∶2.7，temperature 50℃and reaction duration 4 h.Under these conditions，the degrees of substitution of OCC reached 0.78.FTIR analysis confirmed that the substitution reaction occurred in theO atom.

O-carboxymethyl chitosan；the degree of substitution；infrared spectroscopy

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.020

2014-01-21

国家自然科学基金（31101391）；山东省自然科学基金（ZR2010CQ032）；深圳市科技研发资金基础研究计划（JC201105201225A）

孙萍（1969—），女（汉），高级实验师，学士，从事功能性食品开发。

*通信作者：肖军霞（1977—），女（汉），教授，博士，从事功能因子稳态化技术研究。