正交试验法优选柚皮苷的提取工艺

朱名毅，蒙山，高洁，赵爽，卢露碧

（右江民族医学院基础医学院，广西百色533000）

正交试验法优选柚皮苷的提取工艺

朱名毅，蒙山，高洁，赵爽，卢露碧*

（右江民族医学院基础医学院，广西百色533000）

建立高效液相色谱检测柚皮苷含量的方法，通过单因素试验考察提取时间、提取功率、乙醇体积分数和固液比4个因素对柚皮苷提取率的影响，在此基础上运用正交试验法优化柚皮苷的提取工艺。结果表明：柚皮苷的最佳提取工艺为用50%的乙醇，按固液比1∶25进行超声提取60min，超声提取功率50W。该优选工艺合理、稳定可行，在此优化条件下提取柚皮苷的含量是6.134%。

柚皮；柚皮苷；正交试验；提取工艺

广西沙田柚资源丰富，种植面积广，产量大，而柚皮占沙田柚总重的30%左右。目前在沙田柚的食用或加工时，产生的柚皮往往被废弃，不仅浪费资源，而且会造成环境污染[1]。沙田柚皮中富含柚皮苷，而柚皮苷具有良好的抗氧化、降低血脂、促进骨细胞生长等功能[2-4]。柚皮苷易溶于乙醇、甲醇等有机溶剂中，甲醇毒性较大，而乙醇毒性低、价格便宜，易于回收，综合考虑以上因素及实际工业化生产需要，本试验拟对柚皮中柚皮苷的提取工艺进行研究，并初步探讨超声波辅助提取柚皮苷的可行性，以期减少溶剂消耗，降低成本，从而为沙田柚皮中柚皮苷提取提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 试药与仪器

柚皮苷对照品：中国食品药品检定研究院，批号110722-201111，纯度＞98%，供含量测定用；乙醇，分析纯：天津市化学试剂批发公司；甲醇，色谱纯：美国TEDIA公司；纯净水：杭州娃哈哈集团。

新鲜沙田柚2012年11月购于广西百色市某超市，原产地为广西容县。

Ulti Mate3000型高效液相色谱仪：美国戴安公司；DL-180B型超声波清洗器：上海之信公司，功率180W；BS124S万分之一电子天平：德国sartorius公司；DFX-1000A高速中药粉碎机：广州大祥公司。

1.2 方法

1.2.1 柚皮中柚皮苷的提取

将新鲜沙田柚洗净，剥下果皮，分离黄色油胞层和白色海绵层，将白色海绵层切成大小为1 cm左右薄片，50℃烘干至水分含量为70 g/kg～80 g/kg，粉碎过40目（孔径0.45mm）筛，制成柚皮干粉。精确称取1.000 g柚皮干粉，置于100mL锥形瓶中，加入一定量的乙醇溶液超声，过滤，将滤液转入50mL容量瓶中定容待测，取溶液进行HPLC分析测定。

1.2.2 单因素试验

以不同的乙醇体积分数、固液比、提取时间和超声提取功率，分别提取得到滤液，采用HPLC法在283nm处进行柚皮中柚皮苷含量的测定，考察以上4个因素对柚皮苷提取含量的影响。

1.2.3 正交试验

由于在提取工艺优化过程中，4个因素之间是相互影响的，为了全面考察4个因素的影响大小，故设计了一个四因素三水平的L9（34）正交表进行正交试验，考察乙醇体积分数、固液比、提取时间和超声提取功率对柚皮苷提取率的综合影响，从中选择最佳的提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 柚皮苷的含量测定

2.1.1 色谱条件

C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为甲醇-水溶液（体积比80∶20），流速1.0 mL/min，柱温30℃，进样量为20μL，检测波长283 nm。在此条件下，主要成分柚皮苷与其他成分有较好的分离效果，理论塔板数>3 000。见图1、图2。

图1 标准品的色谱图Fig.1 HPLC chromatograghy of standard reference for naringin

图2 提取物的色谱图Fig.2 HPLC chromatograghy of pummelo peel

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取柚皮苷对照品2.0mg，置于20mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制备成200μg/mL的对照品贮备溶液，用0.22μm的有机系一次性针式过滤器过滤。

2.1.3 供试品溶液的制备

精确称取1.000 g柚皮干粉，置于100m L锥形瓶中，加入一定量的乙醇水溶液超声处理一段时间后，过滤，将滤液转入50mL容量瓶中定容待测，每处理重复3次。

2.1.4 线性关系考察

精密量取柚皮苷对照品贮备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL，分别置于20mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配成不同浓度的对照品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件进样检测，以浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，得到柚皮苷标准液的回归方程为Y=1.812 5X-9.934 6，r=0.999 1。结果表明，柚皮苷对照品浓度在0.10μg/m L～0.82μg/m L之间与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验

取柚皮苷对照品溶液20μL，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次检测峰面积，结果其峰面积的RSD为3.56%，表示该方法的精密度良好。

2.1.6 稳定性试验

取同一供试品提取液各20μL，按“2.1.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样，测定其峰面积，结果其峰面积的RSD为2.57%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验

精密称取同一批号供试品6份，每份1.000 g，按“2.1.3”项下条件制备供试品溶液，按“3.1.1”项下测定峰面积并计算含量，结果沙田柚中柚皮苷平均含量1.39%，RSD为2.19%，表明本法具有良好的重复性。

2.1.8 加样回收率试验

取同一份供试品1.000 g，精密称定，分别加入相应量的柚皮苷对照品，按“3.1.3”项下条件制备供试品溶液，按“2.1.1”项下测定峰面积并计算含量，计算回收率，结果平均回收率为101.32%，RSD为1.31%。

2.2 提取条件单因素的考察

2.2.1 乙醇体积分数对柚皮苷提取含量的影响

取柚皮粉末7份，精密称取每份1.000 g，分别加入30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇25mL，以30W功率超声提取60min，滤液用对应浓度的乙醇定容至50mL，按2.1的方法测定滤液中的柚皮苷含量，结果见图3。

图3 乙醇体积分数对柚皮苷提取效果的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction of naringin

由图3的结果可见，50%乙醇具有较好的提取效果，因此我们确定乙醇浓度考察的水平值为40%、50%和60%。

2.2.2 固液比对柚皮苷提取含量的影响

取柚皮粉末6份，精密称取每份1.000 g，按固液比分别是1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30和1∶35的比列加入50%的乙醇，以40W功率超声提取60min，过滤液按2.1的方法测定滤液中的柚皮苷含量，结果见图4。

由图4可知，固液比是1∶25时具有较好的提取效果，因此我们确定固液比考察的水平值为1∶20、 1∶25和1∶30。

图4 固液比对柚皮苷提取效果的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction of naringin

2.2.3 提取时间对柚皮苷提取含量的影响

取柚皮粉末5份，精密称取每份1.000 g，按固液比1∶20加入50%的乙醇20mL，以40W功率超声提取10、20、30、40、50、60min，过滤液按2.1的方法测定滤液中的柚皮苷含量，结果见图5。

图5 提取时间对柚皮苷提取效果的影响Fig.5 Effect of time on the extraction of naringin

由图5可知，超声提取50min能达到较好的提取效果，因此我们确定提取时间考察的水平值为40、50和60min。

2.2.4 提取功率对柚皮苷提取含量的影响

取柚皮粉末5份，精密称取每份1.000 g，按固液比1∶20加入50%的乙醇20mL，超声提取50min，超声提取功率分别20、30、40、50、60W，过滤液按2.1的方法测定滤液中的柚皮苷含量，结果见图6。

图6 提取功率对柚皮苷提取效果的影响Fig.6 Effect of ultrasound on the extraction of naringin

由图6可知，超声提取功率为50W的时候具有较好的提取效果，因此我们确定超声提取功率考察的水平值为40、50、60W。

2.3 沙田柚柚皮苷提取工艺优化

根据单因素考察试验结果，对提取时间、提取功率、乙醇体积分数和固液比4个因素进行正交试验，每个因素选择3个水平值。依照L9（34）正交表安排试验，并按“2.1”的方法，对各工艺所提得柚皮苷含量进行考察，具体因素水平和试验结果及对结果的方差分析，见表1～表3。

表1 柚皮苷提取工艺正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交试验结果表Table2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析结果Table 3 Variance analysis

通过极差分析（表2）和方差分析（表3）可知，在正交试验条件下，4个因素对柚皮苷提取率的影响从大到小依次是：提取时间>乙醇体积分数>固液比>提取功率，而由表3的方差分析结果可知提取时间、乙醇体积分数和固液比对提取率有显著性差异，提取功率对提取率没有显著性影响。综合得到柚皮苷提取工艺的优化条件是A2B2C3D3，即用50%乙醇超声提取，提取功率为50W，提取时间为60min，固液比是1∶25。

2.4 验证试验

取柚皮粉末3份，精密称量每份1.000 g，按照A2B2C3D3的条件制备样品，测定柚皮苷的含量，结果得到3份样品中柚皮苷的含量平均值为6.143%，RSD为1.87%。说明该超声提取工艺稳定、合理。

3 结论

本文建立了简便、快捷的高效液相色谱法，用于测定柚皮中柚皮苷的含量，并对柚皮苷的提取工艺进行了优化。高效液相色谱检测结果表明：柚皮苷在0.10μg/mL～0.82μg/mL（r=0.999 1）范围内线性关系良好，精密度和重复性实验RSD分别是3.56%和2.19%，其加样回收率101.32%，适合柚皮苷的测定。通过单因素和正交试验结果表明：超声波辅助提取柚皮苷的最佳工艺条件为超声提取功率50W，乙醇体积分数50%，固液比1∶25（g/mL），提取时间60min，在该优化工艺条件下提取柚皮苷的含量是6.143%。

[1]阳梅芳,曾新安,杨星,等.沙田柚中不同部位黄酮类物质的分布及含量探讨[J].食品工业科技,2013,34(1):89-91,96

[2] 李赤翎,俞建,曾亮,等.柚皮苷对猪肉的抗氧化作用的研究[J].食品研究与开发,2008,29(10):20-23

[3] 孙胜亮.柚皮活性成分提取分离及其在降血脂方面研究[D].西南大学,2011

[4]唐琪,王维倩,王仁飞,等.柚皮苷对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖功能的影响[J].浙江中医药大学学报,2010,34(2):171-172

Ptimization of Extraction Technology for Nariingin from Pummelo Peel by Orthogonal Experiment

ZHU Ming-yi，MENG Shan，GAO Jie，ZHAO Shuang，LU Lu-bi*
（Department of basic medical，Youjiang Medical University For Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China）

A high performance liquid chromatographic method was developed for determining the content of naringin.The effects of ultrasonic time，ultrasonic power，ethanol concentration and solid-liquid ratio factorson the narngin extraction rate were investigated by single-factor experiments.Based on the above work，the extraction technology of naringin was optimized by orthogonal experiment.The optimal extraction technology was as follow：the ethanol concentration was50%，the solid-liquid ratio was1∶25，the ultrasonic power was 50W and extracting time was 60min.The extraction content of naringin was 6.134%by the above method.

pummelo peel；naringin；orthogonal experiment；extrating technology

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.032

2013-12-03

朱名毅（1982—），男（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：中药资源研究开发与利用。

*通信作者