响应面法优化紫山药色素提取工艺

王卫东，朱连涛，孙月娥，高明侠

（1.徐州工程学院食品（生物）工程学院，江苏徐州 221111；2.江苏省食品资源开发与质量安全重点实验室，江苏徐州 221111）

响应面法优化紫山药色素提取工艺

王卫东1，2，朱连涛1，孙月娥1，2，高明侠1

（1.徐州工程学院食品（生物）工程学院，江苏徐州 221111；2.江苏省食品资源开发与质量安全重点实验室，江苏徐州 221111）

以紫山药为原料，采用溶剂提取法提取紫山药色素。结果表明，紫山药色素的最大吸收波长为540 nm，与丙酮和甲醇相比，体积分数为40%的乙醇对色素的提取率最高。以吸光值为指标，通过单因素试验分别考察了液料比、温度和提取时间等三个因素对紫山药色素提取率的影响，在此基础上采用响应面试验设计对乙醇提取色素的工艺参数进行优化，确定最佳工艺条件为：液料比92（mL/g）、温度58℃、提取时间128min。

紫山药；色素；响应面法

山药（Dioscorea opposita）学名薯蓣，为薯蓣科薯蓣属植物，是我国卫生部公布的药食两用蔬菜。紫山药属于山药的紫红肉品种群，因其皮和肉质含有丰富的花色苷，因此呈现紫红色[1]。紫山药比一般的山药含有更多的维生素和微量元素，特别是它有含多种花色苷，并含有大量的蛋白质、多糖、薯蓣皂甙元等较高营养物质及药理成分[2]。花色苷是一类广泛存在于高等植物中的天然水溶性色素，存在于很多水果、蔬菜和花朵中，呈现红、蓝、紫或者黑的色泽。花色苷不但可以作为天然色素，而且在抗氧化[3]、抗炎症[4]、抗突变[5-6]、抗肿瘤[7]、改善视力[8]、预防和治疗心血管疾病[9]等方面具有良好的作用。从紫山药中提取的色素或者其他多酚类化合物，可作为功能性食品配料或者天然着色剂使用。唐晓伟等[10]采用快速溶剂萃取技术对紫山药色素提取工艺参数进行了优化。倪勤学等[11]采用正交试验法优化了溶剂提取法提取紫山药色素的工艺参数。本文以新鲜的紫山药为原料，采用溶剂提取法，利用Box-Behnken响应面试验对紫山药色素提取工艺进行优化，为紫山药中色素的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫山药：市售；乙醇：国药集团上海试剂公司；其他试剂均为分析纯。

722G型分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；RE5299真空旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DF-15中药粉碎机：温岭市大德中药机械有限公司；LGJ―10真空冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 原料的预处理

新鲜的紫山药清洗，沥干，切片，冷冻干燥，粉碎，过40目筛，装于密封袋中，4℃冷藏备用。

1.2.2 紫山药色素最大吸收波长的测定

称取0.1 g紫山药粉末，加入体积分数为40%的乙醇100mL，超声10min后离心。残渣用40%乙醇重复提取，直到提取液清澈无色。合并提取液，上层水相在30℃下真空浓缩除去乙醇，用水定容到250mL。将一定浓度的提取液在紫外可见分光光度计上扫描，波长范围为500 nm～700 nm，记录最大吸收峰的位置。

1.2.3 提取溶剂对紫山药色素提取率的影响

分别采用体积分数为0%、20%、40%、60%、80 %、100%的乙醇、丙酮、甲醇提取紫山药中的色素，真空浓缩除去有机溶剂后定容到100mL，测定提取液吸光值，比较提取剂对色素的提取效果。

1.2.4 紫山药色素提取工艺优化试验设计

以体积分数40%的乙醇溶液为提取溶剂，以540 nm吸光值为指标，对液料比、提取时间、温度进行单因素试验。根据单因素的试验结果，采用Box-Behnken试验设计原理，以液料比、提取时间和温度为影响因素，设计3因素3水平的响应面试验。试验因素与水平如表1所示。

表1 因素水平表Table1 Independent variables and levels for optimization

2 结果与分析

2.1 紫山药色素的最大吸收波长

利用紫外-可见分光光度计扫描色素提取液，结果如图1所示。可见，紫山药色素的最大吸收波长在540 nm。曾哲玲等[12]采用40%的乙醇提取紫山药色素，发现其在540 nm左右处出现特征吸收峰，与本实验结果一致。所以后续实验中通过测定540 nm处的吸光值评价色素的提取效果，吸光值越大，表明色素的提取率越高。

图1 紫山药色素的可见光谱图Fig.1 Vis spectra of purple yam pigment

2.2 提取剂对色素提取效果的影响

分别取0.2 g的紫山药粉末，以提取剂与紫山药液料比为100∶1（mL/g）的比例，加入不同浓度的乙醇、丙酮、甲醇，在30℃下搅拌提取30min，离心后取上清液，真空浓缩除去有机溶剂，定容到100mL，测定其在540 nm波长处的吸光值，比较不同溶剂对色素提取率的影响，结果如图2所示。

图2 提取剂对色素提取率的影响Fig.2 Effect of extraction solvent on pigment extraction yield

由图2可见，各溶剂浓度低于50%（体积分数）时，乙醇对色素的提取率较高，其中以40%（体积分数）的乙醇提取效果最好；当各溶剂高于50%（体积分数）时，丙酮对色素的提取率较高，但随提取剂浓度的增高呈现下降趋势，故选择40%（体积分数）乙醇为提取剂。

2.3 紫山药色素提取单因素试验

2.3.1 液料比对色素提取效果的影响

取0.2 g紫山药粉末为原料，分别按液料比（m L/g）70、80、90、100的比例加入40%（体积分数）的乙醇溶液作为提取剂，30℃搅拌提取60min，离心后取上清液，测定其在540 nm波长下的吸光值。为消除由于提取剂体积增加对色素提取液浓度的稀释，以液料比70为基准比例，其他比例下测得的吸光值换算成和它相同体积下的吸光值，比较液料比对提取效果的影响，结果如图3所示。

图3 液料比对色素提取率的影响Fig.3 Effect of ratio of liquid：solid ration on pigment extraction yield

由图3可见，随着液料比的增大，提取液的吸光值也增加，当液料比达到90时，吸光值最大。此后当液料比继续增加，吸光值基本不变，表明色素提取率不再增加。因此，当选择液料比为90时，既有利于紫山药色素的提取，也利于减少溶剂的浪费，减少后续浓缩步骤的成本。

2.3.2 提取温度对提取率的影响

取0.2 g紫山药粉末，按液料比90的比例加入40%（体积分数）的乙醇溶液作为提取剂，分别在30、40、50、60、70℃时搅拌提取60min，离心后取上清液，测定其在540 nm波长下的吸光值，比较温度对提取效果的影响，结果如图4所示。

图4 提取温度对色素提取率的影响Fig.4 Effect of temperature on extraction yield of pigment

由图4可见，在一定范围内，随着提取温度的增加，紫山药色素提取率不断增加，当提取温度达到60℃时，提取率达到最大，随后再增加提取温度，提取率反而降低了。这是因为紫山药色素在较高温度下发生了降解，吸光值减小。因此，选择提取温度为60℃。

2.3.3 提取时间对色素提取率的影响

取0.2 g紫山药粉末，按液料90的比例加入浓度为40%（体积分数）的乙醇作为提取剂，60℃恒温搅拌提取30、60、90、120min，离心后取上清液，测定其在540 nm波长下的吸光值，比较提取时间对提取效果的影响，结果如图5所示。可见，随着提取时间的增加，色素的提取率不断增加。当提取时间为120min时，提取率达到最高。因此选择提取时间为120min。

图5 提取时间对花色苷提取率的影响Fig.5 Effect of time on extraction yield of ACN

2.4 紫山药色素提取的最佳工艺参数

2.4.1 响应面试验模型的建立及其结果

根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验的基础上，选取提取温度（X1）、液料比（X2）和提取时间（X3）三个影响因素，采用三因素三水平的响应曲面试验设计对花色苷提取率（y）进行优化[13]。设该模型通过最小二乘法拟合的二次多项方程为：

式中：B0为常数项，Bi为线性系数；Bij为交互项系数；Bii为二次项系数；ε为随机误差。按照 Box-Behnken试验设计的统计学要求，对上述方程的各项回归系数进行回归拟合。试验设计与结果见表2。

表2 试验设计与结果Table 2 Box-Behnken design with the observed responses

利用Design expert V 8.0统计软件通过逐步回归对表2中的试验数据进行回归拟合，得到吸光值对以上 3个因素的二次多项回归模型为：Y=1.43+ 0.093X1-0.18X2+0.13X3+0.022X1X2-0.01X1X3+0.025X2X3-0.19X12-0.46X22-0.25X32。对该模型进行方差分析，结果见表3。

表3 二次回归方程模型方差分析Table3 ANOVA for the regression model

由表3可知，模型具有高度显著性（P＜0.01），失拟项不显著（p＞0.05）以及RSN（信噪比）为17.416，可知回归方程拟合度和可信度均很高，实验误差较小，故可用此模型对紫山药色素提取的工艺结果进行分析和预测。根据统计学计算原理可知，回归方程相关系数R2为0.982 3，说明模型能解释98.23%响应值的变化，说明该模型与实际实验拟合程度良好，用该模型对乙醇提取紫山药色素的提取过程进行优化是合适的。

2.4.2 响应曲面分析与优化

根据回归方程，作响应曲面图，考察所拟合的响应曲面的形状，分析液料比、温度以及提取时间对色素提取率的影响。模型的响应面及其等高线如图6、图7和图8所示。

等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反[14]。比较3组图并结合表3中p值可知：模型的一次项X1（p＜0.05）显著，X2、X3（p＜0.01）高度显著，交互项均不显著（P>0.05）；二次项均高度显著（p＜0.01）。因此，各影响因素对紫山药色素的影响不是简单的线性关系。液料比、温度和提取时间对提取率有显著的影响，各因素之间的交互作用对提取率没有造成显著影响。

图6 液料比、温度对色素提取率影响的响应面和等高线Fig.6 Response surface and contour plot showing effect of liquid: solid ration and temperature on extraction yield of pigment

图7 提取时间、温度对色素提取率影响的响应面和等高线Fig.7 Response surface and contour plot showing effect of time and temperature on extraction yield of pigment

图8 提取时间、液料比对色素提取率影响的响应面和等高线Fig.8 Response surface and contour plot showing effect of time and liquid:solid ration on extraction yield of pigment

为进一步确定最佳提取工艺参数，采用Design expertV 8.0统计软件对模型进行优化求解，可得最佳工艺参数为液料比92∶1（mL∶g），温度58℃，提取时间128min，此时紫山药色素提取液吸光值为1.477。

2.4.3 验证实验

为检验Box-Behnken试验设计所得结果的可靠性，采用上述最优提取条件进行紫山药色素的提取实验，在此条件下进行3次平行实验，实际测得提取液的平均吸光值为1.489，与预测值基本相符，因此，基于Box-Behnken试验设计所得的最佳工艺参数准确可靠，具有实用价值

3 结论

紫山药色素最大吸收波长为540 nm，不同提取剂对其提取效果不同，40%（体积分数）乙醇溶液提取效果最好。液料比、温度和提取时间对紫山药色素提取率有显著影响，由单因素和Box-Behnken试验设计及其分析结果获得乙醇提取紫山药色素的最佳工艺参数为液料比92∶1（g∶mL），温度58℃，提取时间128min。

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Optimization of Extraction of Purple Pigment from Yam Using Response Surface Methodology

WANG Wei-dong1，2，ZHU Lian-tao1，SUN Yue-e1，2，GAO Ming-xia1
（1.College of Food and Biological Engineering，Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221111，Jiangsu，China；2.Jiangsu Key Laboratory of Exploitation of Food Resources and Food Quality Safty，Xuzhou 221111，Jiangsu，China）

Purple yam pigment was extract by solvent extraction method.The results indicated that aqueous alcohol extracts produced the absorption maximas at 540 nm.A aqueous alcohol concentration of 40%（v/v）extracted maximum pigments，compared with acetone and methanol.Effects of three factors of liquid：solid ratio，temperature and extraction time were studied.Based on it，conditions of extraction were optimized by response surface design.The optimum conditions of extraction were a liquid∶solid ratio of 92∶1（mL/g），temperature of 58℃and extaction time of128min.

purple yam；pigment；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.005

2013-12-07

国家科技富民强县专项行动计划项目（BN2012105）

王卫东（1971—），男（汉），副教授，研究生，研究方向：功能性食品配料与添加剂。