枯草芽胞杆菌L-天冬氨酸a脱羧酶的酶学性质

邓思颖，张君丽，蔡真，李寅



枯草芽胞杆菌L-天冬氨酸a脱羧酶的酶学性质

邓思颖1,2，张君丽3，蔡真1，李寅1

1 中国科学院微生物研究所，北京 100101 2 中国科学院大学，北京 100049 3 中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308

邓思颖, 张君丽, 蔡真, 等. 枯草芽胞杆菌L-天冬氨酸a脱羧酶的酶学性质. 生物工程学报, 2015, 31(8): 1184–1193.Deng SY, Zhang JL, Cai Z, et al. Characterization of L-aspartate-a-decarboxylase from Bacillus subtilis. Chin J Biotech, 2015, 31(8): 1184–1193.

b-丙氨酸是一种重要的医药化工原料，目前主要依靠化学法进行生产。探寻更为环保和高效的生物生产法是未来研究的一个方向。L-天冬氨酸a脱羧酶 (PanD) 能特异地脱去L-天冬氨酸的a羧基，生成b-丙氨酸。本文比较了3种分别来源于大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌及枯草芽胞杆菌的PanD比酶活 (分别为0.98、7.52和8.4 U/mg)。后两者的最适pH均为6.5，最适反应温度分别为65 ℃及60 ℃。与目前研究最多的来源于大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的PanD相比，来源于枯草芽胞杆菌的PanD具有更好的活性和热稳定性，具有更强的工业应用潜力。同时，本文对该酶特有的翻译后自剪切及机理性失活现象进行了分析和讨论。

L-天冬氨酸a-脱羧酶，b-丙氨酸，枯草芽胞杆菌，谷氨酸棒状杆菌，酶学性质

b-丙氨酸是自然界中唯一存在的b型氨基酸，是一种非蛋白氨基酸。目前b-丙氨酸主要用于合成泛酸钙、肌肽、帕米磷酸钠、b-丙氨酸金属配合物和巴柳氮等医药化工领域重要产品[1]。国内外多以化学法合成b-丙氨酸。化学合成法或是需要高温高压，或是产生大量的盐，或是副反应多，对动力和三废处理的要求较高[1]。因此探索更为环保的生物法生产b-丙氨酸是未来的一个研究方向。

研究发现L-天冬氨酸a脱羧酶 (L-aspartate-a-decarboxylase，EC4.1.1.11，PanD)能特异性识别L-天冬氨酸，催化其脱掉a羧基生成b-丙氨酸。目前b-丙氨酸和L-天冬氨酸的售价有4−5倍的差值，这使得由L-天冬氨酸生物法生产b-丙氨酸极具工业化潜能。因此生物生产法的研究重点是如何寻找到一个高效的PanD。

研究发现PanD仅存在于微生物和植物中，是泛酸合成途径中的关键酶[2]。PanD是1个非常特殊的四聚体蛋白[3]。它转录翻译后得到1个无活性的前体蛋白 (p-蛋白，约14 kDa)。p-蛋白在第24位甘氨酸(Gly24) 和第25位丝氨酸(Ser25)之间发生分子内重排，从而导致肽链断裂，自剪切形成1个C端含有羟基的b-亚基 (约3 kDa) 和1个N端含有丙酮酰基的a-亚基 (约11 kDa)。这2个亚基的空间位置非常紧密，但却没有共价键链接[2]。而PanD的四聚体蛋白则是由3个剪切的p-蛋白和1个未剪切的p-蛋白组合而成，其中未剪切的p-蛋白在Gly24-Ser25处已发生重排形成酯键[4]。

目前报道的PanD主要来源于大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌及部分病原菌 (幽门螺旋杆菌、肺结核杆菌)。对PanD(PanD) 的研究主要集中于结构解析和自剪切机理[3-7]。对病原菌PanD的研究则主要希望找到其剪切和催化的关键位点作为抗菌药物的新靶点[8-9]。这些研究均很少关注PanD的酶学性质。目前只有来源于和的PanD有酶活数据[10-12]。而对于选取生物催化剂时至关重要的几个考虑因素 (如比酶活、最适反应条件、热稳定性等) 却鲜有报道。这为选择一个高效的PanD来催化L-天冬氨酸生产b-丙氨酸带来困难。

本研究通过前期筛选发现，来源于枯草芽胞杆菌的PanD(PanD)具有较高的比酶活。随后详细测定了它的最适温度、最适pH、热稳定性及转化L-天冬氨酸生产b-丙氨酸的能力等，并与目前研究较多的来源于和的PanD进行比较。研究结果表明PanD具有更高的活性和更好的热稳定性，因而具有更好的工业应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及质粒

subsp.str. 168、ATCC 13032及BL21(DE3)均来自实验室菌种保藏。质粒pET-30a(+)购自Novagen公司。

1.1.2 主要酶、引物及试剂

DNA聚合酶、各限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自NEB公司；基因组DNA提取试剂盒、质粒DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒及PCR产物纯化试剂盒均购自Omega公司；His Trap纯化柱购自Novagen公司。本研究所用引物序列如表1所示。

表1 本研究中所用到的引物

1.2 方法

1.2.1 基因克隆及表达质粒构建方法

分别以subsp.str. 168、ATCC 13032及BL21(DE3)的基因组为模板，以PanD-For和PanD-Rev、PanD-For和PanD-Rev以及PanD-For和PanD-Rev为引物对在100mL体系中扩增片段，从而得到N端带有His标签的DNA片段panD、panD及panD。利用Ⅰ及Ⅰ双酶切后连接到经同样酶切的质粒载体pET-30a(+)上，获得重组质粒pET-30a-panD、pET-30a-panD及pET-30a-panD。同时利用引物对PanZ-For和PanZ-Rev从基因组克隆得到基因，利用A Ⅰ连接于panD之后得到重组质粒pET-30a-panD-panZ。

1.2.2 重组蛋白诱导表达、纯化及SDS-PAGE检测方法

将重组质粒pET-30a-panD、pET-30a-panD、pET-30a-panD及pET-30a-panD-panZ分别转化感受态细胞BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/panD、BL21(DE3)/panD、BL21(DE3)/panD及BL21(DE3)/panD/。从平板上分别挑取各个重组菌的单菌落，接种于5 mL含50mg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基，37 ℃、200 r/min振荡过夜培养。将1 mL上述过夜培养物接种于100 mL含50mg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养至菌液600=0.4后加入IPTG至终浓度0.2 mmol/L。30 ℃振荡培养12 h后收集100 mL菌体。将收集菌体用10 mL的超声缓冲液 (HEPPS 0.1 mol/L，pH 8.0；EDTA 1 mmol/L；MgCl220 mmol/L) 复悬后进行超声破碎。超声破碎上清经His Trap柱纯化 (方法参照Novagen His Bind Kits) 后用SDS-PAGE检测纯度。

1.2.3b-丙氨酸及L-天冬氨酸浓度的HPLC检测方法

流动相：0.035 mol/L乙酸钠，30% (/)甲醇水溶液。衍生剂：邻苯二甲醛0.1 mol/L，N-乙酰-L-半胱氨酸0.036 mol/L，20% (/)乙醇水溶液。衍生反应：取300mL待测样品加入360mL硼酸钠缓冲液 (0.05 mol/L，pH 9.5)，再加入240mL衍生剂，充分混匀后静置 2 min，之后进样10mL检测。色谱柱为Aglent ZRABOX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，检测波长334 nm，柱温30 ℃，流速1 mL/min。

1.2.4 重组酶最适温度的测定

酶活定义：每分钟转化底物L-天冬氨酸生成1mmol产物b-丙氨酸所需的酶量为1个酶活力单位 (1 U)。

将25mg重组酶加入1 mL含50 mmol/L L-天冬氨酸的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液 (0.1 mol/L，pH 7.0) 中，分别于37、45、55、60、65、70、75及80 ℃下反应20 min，加入0.1 mL NaOH溶液 (1 mol/L) 终止反应，利用HPLC测定b-丙氨酸产量并计算酶活。

1.2.5 重组酶热稳定性的测定

将25mg重组酶加入0.933 mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液 (0.1 mol/L，pH 7.0) 中，分别于37、50、60及65 ℃下温育12 h。然后加入67mL L-天冬氨酸溶液 (750 mmol/L，NaOH溶解，pH 7.0)，在相同温度下反应20 min。加入0.1 mL NaOH溶液 (1 mol/L) 终止反应。利用HPLC测定b-丙氨酸产量并计算酶活。

1.2.6 重组酶反应过程中稳定性的测定

将25mg重组酶加入1 mL含50 mmol/L L-天冬氨酸的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液 (0.1 mol/L，pH 7.0) 中，分别于37、50及60 ℃下反应20 min、40 min、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h及4 h，加入0.1 mL NaOH溶液 (1 mol/L) 终止反应，利用HPLC测定b-丙氨酸产量随时间变化的曲线。将曲线进行多项式拟合，以2值大于99%为宜。对该多项式求导，计算各个时刻的瞬时酶活。

1.2.7 重组酶最适pH的测定

将25mg重组酶分别加入0.933 mL的pH 5.0、5.6、6.0、6.5、7.0、7.6、8.0及9.0的缓冲液中静置5 min，后加入67mL L-天冬氨酸溶液 (750 mmol/L，NaOH溶解，pH 7.0)。37 ℃下反应20 min，后加入0.1 mL NaOH溶液 (1 mol/L) 终止反应。利用HPLC测定b-丙氨酸产量并计算酶活。

pH 5.0、5.6、6.0缓冲液用0.05 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制。pH 6.5、7.0缓冲液用0.1 mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制。pH 7.6、8.0、9.0缓冲液用0.02 mol/L巴比妥钠-盐酸缓冲液配制。

1.2.8 重组酶的转化实验

将7.5 mg重组酶投入300 mL的L-天冬氨酸溶液 (50 mmol/L，NaOH溶解，pH 6.5) 中。37 ℃水浴，350 r/min搅拌，并鼓泡通气，用 1 mol/L H2SO4控制反应体系pH为(6.5±0.3)。

2 结果与分析

2.1 重组酶的构建及纯化

通过PCR从、及基因组中克隆得到长度分别为384、411及381 bp的基因片段panDpanD及panD，并通过引物在其N端加入含有6个组氨酸的His6标签。将上述基因片段置于pET-30a(+)上T7启动子下游，得到3个重组质粒pET-30a-panD、pET-30a-panD、pET-30a-panD。考虑到PanD必须在另一蛋白PanZ的辅助下才能在常温下发生自剪切[5]，因此我们从基因组中克隆得到384 bp的片段，将其连同T7启动子一起插入pET-30a-panD中，得到重组质粒pET-30a-panD-panZ。

将上述4个重组质粒转化BL21(DE3)，在0.2 mmol/L IPTG作用下30 ℃诱导12 h后破碎细胞。利用镍柱对超声破碎液进行亲和纯化，纯化后的重组酶SDS-PAGE验证结果如图1所示，纯度均在90%以上。

如图1所示，在没有基因的情况下，表达PanD后得到的是完全没有剪切的无活性的p-蛋白。而在共表达基因后，PanD几乎完全剪切，形成a亚基 (约12−13 kDa) 及b亚基 (约2.8 kDa)。有趣的是，PanD和PanD不需要任何辅助因子即可完成自剪切。这表明不同来源的PanD有着不同的剪切机理。

图1 PanD的纯化

2.2 重组酶的比酶活

在常规反应条件 (37 ℃，pH 7.0) 下，3种重组酶的比酶活分别为0.98、7.52和8.4 U/mg。由于PanD比酶活太低，且在表达过程中需要添加PanZ辅助剪切，较难实现工业应用，因此后续实验主要以PanD及PanD为研究对象。

2.3 重组酶的最适反应条件

PanD和PanD在不同温度下的酶活如图3A所示。两者的酶活随温度升高均呈现先急剧上升后快速下降的趋势，其最适温度分别为65 ℃和60 ℃。两者在最适反应温度下的酶活为15.2 U/mg和17.2 U/mg，分别为37 ℃酶活的2.4倍和2.3倍。表明该酶的活性对温度变化非常敏感。另外，各个温度下PanD的酶活均比PanD高出13%左右。

图2 PanD的比酶活

37 ℃下PanD和PanD的酶活随pH同样呈现先上升后下降的趋势，但在pH 5.0到9.0之间，两者的酶活变化幅度仅为45%左右。这说明该酶具有较宽范围的pH适应性。2个酶的最适pH均为6.5 (图3B)。酸性条件下PanD的优势不明显，而在中性及碱性条件下，PanD的酶活普遍比PanD高出10%−20%。

2.4 重组酶的稳定性

PanD和PanD在不同温度下温浴12 h后的残余活性如图4 A所示。37 ℃温浴12 h后，PanD和PanD的酶活损失仅为1%和8%。说明两者在该温度下具有较好的稳定性。随着温浴温度升高，两者的酶活损失也增多。65 ℃条件下两者的酶活损失分别增至27%和57%。对比2组数据可以看出，各个温度下PanD的酶活损失均高于PanD，且温度越高这种差距越明显，表明PanD具有更强的热稳定性。

PanD和PanD在不同温度下反应的稳定性如图4B所示。各个温度下，两者的酶活随反应时间线性失活，且温度越高，失活速率越快。37 ℃反应1 h，两者酶活损失约为14%−18%。50 ℃反应1 h，两者酶活损失约为46%−52%。而60 ℃反应1 h酶活损失约为90%−96%。与图4A中温浴的酶活损失相比，这2个酶在反应时酶活损失非常剧烈。比如，60 ℃温浴12 h，PanD和PanD的酶活损失为27%及57%，而同样温度下反应1 h，两者的酶活损失即高达96%和90%。这是因为PanD属于丙酮酰基依赖型脱羧酶，在催化过程中会出现因电子错误重排导致活性中心改变而发生机理性失活[13-15]。这种机理性失活和催化过程相伴相生，且催化越多，失活越快。这也可以解释由于PanD的酶活略高于PanD，因而在反应过程中会表现出比PanD略快的失活。

2.5 重组酶的转化实验

虽然提高反应温度有助于提高PanD和PanD的酶活，但在高温条件下反应时，酶活损失非常快，因此我们仍然选取常规的37 ℃进行转化实验。转化过程中每隔1 h测定反应体系中b-丙氨酸的浓度，结果如图5所示。无论是哪个酶，b-丙氨酸产量均未随反应时间线性增长，这是由于2.4小节中提到的机理性失活所致。转化8 h后，PanD得到2.23 g/Lb-丙氨酸，比PanD提高18%，具有更大的工业应用潜力。

图5 PanD的转化实验

3 讨论

在石油资源枯竭以及生存环境恶化的大背景下，化学品的生物生产法因其能耗低、污染小而备受瞩目。而生物催化走向工业化生产的最大障碍是能否找到一个足够高效和廉价的生物催化剂。因此酶的搜寻和改进一直是生物催化的核心。本课题组在前期筛选过程中发现来源于的PanD具有更高的比酶活。本文的详细表征也表明该酶具有更好的热稳定性，并能在实际转化过程中得到更多的产物，为生物催化L-天冬氨酸生产b-丙氨酸提供了一个更好的催化剂选择。

本研究中3种不同来源的PanD的氨基酸序列相似性不高，如图6所示，仅为53.0%。其中a亚基的相似性为72.2%，而b亚基相似性仅为48.7%。其中，PanD和PanD两者的氨基酸序列相似性为48.91%，略高于它们各自与PanD的相似性 (44.88%和39.71%)，这或许可以解释前两者与后者的酶学性质差别较大的原因。NCBI上公布的PanD序列超过5 000种，有大量潜在基因值得分析比较。通过基因筛选有望获得更高酶活和稳定性的PanD。

图6 PanD序列比对

PanD作为丙酮酰基依赖型的脱羧酶，需要在翻译后通过电子重排促使肽链断裂，形成丙酮酰基[2]。早期研究普遍认为PanD的剪切是完全自发进行的。直到2012年才发现来源于和沙门氏菌的PanD必须在另一蛋白 (PanZ或PanM) 的作用下才能在常温下进行剪切形成丙酮酰基[5,16]。而本研究也证实，PanD在没有PanZ时几乎完全不剪切，而过表达PanZ后几乎完全剪切。表明PanZ确实能促进PanD剪切。但是PanD和PanD却完全不需要任何促进因子。究竟是什么造成了这种剪切的差异还有待进一步研究。Nozaki等[5]曾对32种不同来源的PanD进行了氨基酸序列比对，并在其基因组中搜索PanZ同源序列。结果表明，PanZ只存在于以为代表的肠道内生菌中，这可能是由于肠道内生菌生活在泛酸相对丰富的环境中，细菌通过PanZ调节PanD自剪切能有效控制b-丙氨酸的生成，从而调控泛酸的代谢[5,16]。已有研究表明PanZ/PanM受到乙酰-CoA的调控，对于微生物体内泛酸的合成途径具有一定的调节作用[5,16-17]。

PanD的另一个显著特点是存在机理性失活。1987年Anton等[14-15]发现S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶 (丙酮酰基依赖型脱羧酶) 在转化过程中发生快速失活。随后机理研究表明失活的原因是酶-底物复合物脱羧后的电子错误重排。丙酮酰基作为活性中心，会与底物结合形成1个含有席夫碱的酶-底物复合物。该复合物发生脱羧后形成1个烯醇化物类似物。若该烯醇化物类似物发生正确的电子重排，则会形成新的希夫碱，水解生成产物并还原酶分子上的丙酮酰基。若电子重排错误则不能形成希夫碱，后续水解释放醛化底物并在酶分子上生成丙氨酸残基，即活性中心发生转氨基作用而失活[9,18-19]。

虽然对于S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的机理性失活研究较为透彻，但关于PanD的机理性失活现象直到2009年才有报道。研究者发现来源于PanD在转化过程中会发生不可逆失活，且这种失活不能通过固定化手段来减少[20]。我们研究表明PanD和PanD在多个反应温度下均存在机理性失活，而且反应温度越高，酶活越高，失活也越快。因而推测PanD可能具有和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶同样的失活机理。由于机理性失活中酶的失活和产物生成是两条相伴相生的并行路径，形成了“不催化则不失活，催化越多失活越快”的矛盾。传统的优化反应条件、固定化酶等手段均无法改善。因此，我们认为，只有对酶分子本身进行改造，特别是对酶分子中那些与催化密切相关的氨基酸进行改造，才有可能改变现有的酶-底物复合物发生正确重排和错误重排的比例，减少机理性失活。而且理论上，如果改变后的酶分子结构有利于酶-底物复合物的正确电子重排，则其催化效率也有可能增加，从而实现稳定性和催化活性的同步提高。这部分工作我们也正在进行中。

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(本文责编 陈宏宇)

Characterization of L-aspartate-a-decarboxylase from

Siying Deng1,2, Junli Zhang3, Zhen Cai1, and Yin Li1

1 Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 3 Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

As an important material in pharmaceutical and chemical industry,b-alanine was mainly produced by chemical methods. L-aspartate-a-decarboxylase could catalyze thea-decarboxylation from L-aspartate tob-alanine. Determinations for specific activities of PanDs from,andwere performed in this study (0.98 U/mg, 7.52 U/mg and 8.4 U/mg respectively). The optimal temperature and pH of PanDs from.and.were 65 °C, pH 6.5 and 60 °C, pH 6.5 respectively. According to our research, PanD from.could be more appropriate for industrial application because of the higher activity and thermostability when compared to PanDs from.and.which had been the most studied. We also analyzed and discussed the special post-translation self-cleavage phenomenon and the mechanism based inactivation.

L-aspartate-a-decarboxylase,b-alanine,,, enzyme characterization

10.13345/j.cjb.140109

February 20, 2014; Accepted: March 27, 2014

National Natural Science Foundation of China (No. 21106175).

Yin Li. Tel/Fax: +86-10-64807485; E-mail: yli@im.ac.cn

国家自然科学基金(No. 21106175) 资助。