HPV E6/E7 mRNA在CIN II及以上病变中的诊断价值

黄凌霄，潘琼慧，郑建琼，朱雪燕，朱雪琼

（1.温州医科大学第三临床学院 温州市人民医院 妇产科，浙江 温州 325000；2.温州医科大学附属第二医院 妇产科，浙江 温州 325027）

·论 著·

HPV E6/E7 mRNA在CIN II及以上病变中的诊断价值

黄凌霄1，潘琼慧1，郑建琼1，朱雪燕1，朱雪琼2

（1.温州医科大学第三临床学院 温州市人民医院 妇产科，浙江 温州 325000；2.温州医科大学附属第二医院 妇产科，浙江 温州 325027）

目的：探讨人乳头瘤病毒（HPV）E6/E7 mRNA检测在CIN II及以上宫颈病变（CIN II+）诊断中的应用价值。方法：2014年1月至9月在温州市人民医院妇科门诊行宫颈筛查发现新柏超薄液基细胞学检查（TCT）≥未明确意义的非典型鳞状上皮细胞（ASCUS）和/或高危HPV DNA阳性的患者426例，其中TCT结果为ASCUS者156例，均行宫颈HPV E6/E7 mRNA检测和组织病理学检查。根据病理结果将病例分为5组，分析HPV E6/ E7 mRNA拷贝数与病变程度的相关性。利用受试者工作特征（ROC）曲线评价HPV E6/E7 mRNA对ASCUS患者CIN II+的预测价值。结果：宫颈癌组HPV E6/E7 mRNA拷贝数最高，慢性子宫颈炎组拷贝数最低。Spearman等级相关分析显示组织学病变程度与HPV E6/E7 mRNA水平与之间存在正相关性（r=0.549，P＜0.001)。在CIN II+中，HPV E6/E7 mRNA阳性率为91.6%，HR-HPV DNA阳性率为93.0%，差异无统计学意义（x2=0.197，P＞0.05）。ROC曲线显示，HPV E6/E7 mRNA预测CIN II+最佳临界值为147.965。HPV E6/E7 mRNA与HR-HPV DNA检测预测ASCUS患者CIN II+的灵敏度、阴性预测值相比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；两者特异度、阳性预测值比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：随着宫颈病变程度增加，HPV E6/ E7 mRNA拷贝数相应增加。与HPV DNA检测方法相比，HPV E6/E7 mRNA检测对ASCUS患者CIN II+的特异度、阳性预测值更高，可作为ASCUS患者分流管理的有效措施。

E6/E7 mRNA；人乳头瘤病毒；DNA；宫颈病变

高危型人乳头瘤病毒（high risk-human papilloma virus，HR-HPV）持续感染是宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和宫颈癌发生的主要病因，特别是HPV癌基因E6/E7的表达对于恶性肿瘤的转归和维持起着重要作用，但由于E6/E7感染宿主的环境因素的差异，感染的自然进展在不同人群间存在着差异，在不同病变级别的宫颈组织中也存在着差异。本研究采用支链DNA信号放大技术（branched DNA，bDNA）检测HPV E6/E7 mRNA在宫颈病变中的表达水平，探讨各级别间HPV E6/E7 mRNA拷贝情况，评估其在CIN II及以上宫颈病变早期诊断中的应用价值。

1 资料和方法

1.1 一般资料 2014年1月至9月因新柏超薄液基细胞学检查（thin-prep cytology test，TCT）≥未明确意义的非典型鳞状上皮细胞（atypical squa

mous cells of undermined significance，ASCUS）和/或HR-HPV DNA阳性的患者426例，均行HPV E6/ E7 mRNA检查及阴道镜下宫颈活检，其中TCT结果为ASCUS 156例。426例患者年龄24～76岁，均无CIN史、盆腔放射治疗史、子宫切除史，排除妊娠，取材前3 d内无性生活史。

1.2 方法

1.2.1 TCT检查：宫颈刷插入宫颈外口旋转5周，采集宫颈表面及宫颈管内脱落细胞，将细胞洗脱在新柏氏膜式液基液中，用TCT专用制片机制成薄层涂片，经巴氏染色后镜检。宫颈细胞学诊断按照国际癌症协会推荐的TBS分类法，具体分为未见上皮内瘤变或恶性细胞（negative for intraepithelial lesion and malignancy，NILM）、ASCUS、不排除高度鳞状上皮病变的非典型鳞状上皮细胞（atypical squamous cells cannot exclude HSIL，ASC-H）、低度鳞状上皮内瘤变（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）、高度鳞状上皮内瘤变（high-squamous intraepithelial lesion，HSIL）及鳞癌（squamous cell cancer，SCC）。

1.2.2 HPV DNA检测：用HPV专用毛刷取材，将鳞柱上皮交界处和宫颈管采集的细胞洗脱在HPV专用取样瓶中。采用PCR反向点杂交技术进行分型。共分23种亚型，低危型5种，包括HPV 11、42、43、6、81；高危型18种，包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82、83。1.2.3 HPV E6/E7 mRNA检测：采用bDNA法检测脱落细胞中14种HR-HPV E6/E7 mRNA水平，包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68。试剂盒购自河南中美合资科蒂亚生物技术有限公司，严格按照说明书进行操作。标本采用冷光仪检测，检测结果为光子数，经计算软件转换为拷贝数，拷贝数＞0 copy/mL为阳性。

1.2.4 组织病理学检查：TCT≥ASCUS和/或HR-HPV DNA阳性的患者行阴道镜下宫颈活检。病理学诊断分为：慢性子宫颈炎、CINI、CIN II、CIN III、宫颈癌，诊断标准参照《妇产科学》[1]。对病理检查结果≥CIN II的患者行宫颈环形电切术或宫颈锥切术，以获取进一步病理诊断。若不同部位有不同级别诊断，以病理级别最高者作为最后诊断。

1.3 统计学处理方法 对5组不同宫颈病变的HPV E6/E7 mRNA拷贝数进行探索性研究，结果用箱线图表示。采用SPSS19.0统计软件进行分析，HPV E6/E7 mRNA拷贝数比较采用Mann-Whitney检验。率的比较采用x2检验或Fisher精确概率检验。相关性分析采用Spearman等级相关分析。诊断价值采用受试者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲线分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理检查结果与HPV E6/E7 mRNA拷贝数比较由图1可见，5组不同级别宫颈病变的HPV E6/E7 mRNA拷贝数均呈偏态分布，随着病变级别增高，HPV E6/E7 mRNA拷贝数有增高趋势。对各组HPV E6/E7 mRNA拷贝数进行分析（见表1），宫颈癌组HPV E6/ E7 mRNA拷贝数最高，慢性子宫颈炎组最低，CIN II与CIN III组拷贝数差异无统计学意义（P＞0.05）。将宫颈组织病理结果与HPV E6/E7 mRNA水平进行Spearman等级相关分析，两者相关系数r=0.549（P＜0.001），提示HPV E6/E7 mRNA水平与组织学病变程度之间存在正相关性。

图1 组织学不同级别病变HPV E6/E7 mRNA水平的箱线图

表1 组织学不同级别病变HPV E6/E7 mRNA拷贝数比较（copy/ mL）

2.2 HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA及病理检查结果由表2可见，各组间HPV E6/E7 mRNA阳性率有差异。CIN II+组（CIN II、CIN III、宫颈癌）HPV E6/E7 mRNA阳性率显著高于慢性子宫颈炎和CINI组，差异有统计学意义（P＜0.001）。HPV E6/E7 mRNA和HRHPV DNA检测相比较，两者对于CIN II+的检出率差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 HPV E6/E7 mRNA、HR-HPV DNA表达与宫颈病变之间关系n（%）

2.3 HPV E6/E7 mRNA与HR-HPV DNA对ASCUS患者CIN II+的诊断 接受宫颈活检的426例患者中TCT结果为ASCUS者156例。由图2可见，HPV E6/E7 mRNA、HR-HPV DNA诊断ASCUS患者CIN II及以上宫颈病变的ROC曲线下面积分别为0.800（95%CI：0.727～0.873）、0.563（95%CI：0.470～0.657）。HPV E6/E7 mRNA检测的临界值为147.965，以HPV E6/E7 mRNA拷贝数≥147.965为预测界值，其预测CIN II+的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为90.0%、64.2%、54.2%、93.2%。HR-HPV DNA阳性预测CIN II+的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为94.0%、22.6%、36.4%、88.9%。两方法预测CIN II+的灵敏度、阴性预测值差异无统计学意义（P＞0.05），但HPV E6/E7 mRNA预测CIN II+的特异度、阳性预测值均高于HR-HPV DNA检测（P＜0.05），见表3。

图2 HPV E6/E7 mRNA与HR-HPV DNA预测ASCUS患者CIN II+的ROC曲线

表3 ASCUS患者HPV E6/E7 mRNA、HR-HPV DNA表达与宫颈病变之间关系（例）

3 讨论

宫颈癌是女性最常见的妇科恶性肿瘤之一，HPV感染是宫颈癌发生的主要危险因素。几乎100%的高级别CIN以及宫颈癌都合并HPV感染[2]。其发生的分子机制是病毒DNA将以E6/E7为主的基因片段整合到宿主细胞的DNA中，通过激活调节病毒生长的E6/E7基因片段，致E6/E7癌基因蛋白的持续性高表达，使宿主细胞性质发生改变，进而向宫颈高度病变进展[3]。因此HPV E6/E7表达上调是宫颈细胞向恶性转变所必需的。

HPV DNA检测现广泛用于宫颈病变的筛查和随访，尤其是在ASCUS患者的分流中有重要作用。ASCUS的诊断标准为细胞出现比单纯反应性改变更加显著的异常特征，但未达到诊断鳞状上皮内病变的程度，其可能提示慢性子宫颈炎、CIN，甚至是宫颈癌[4-5]。故应十分重视和加强对ASCUS患者及时、有效地评价和管理，防止宫颈浸润癌的发生。2012年美国阴道镜和病理学会（American Society of Colposcopy and Cervical Pathology，ASCCP）提出对于ASCUS的最佳方案为反馈性HPV检测，阳性者行阴道镜检查[6]。但HPV DNA检测不能区分宫颈退行性HPV感染、持续性HPV感染及进行性发展的HPV感染，且HPV DNA在凋亡细胞及细胞碎屑中也可表达，这导致HPV DNA阳性结果不能准确说明致癌风险，反而增加患者对宫颈癌的精神心理负担，甚至出现过度治疗[7-8]。因此需采取更好的方法对ASCUS患者的HPV感染进行检测，进一步筛选出高级别宫颈病变甚至是宫颈癌。

本研究发现，CIN II+（CIN II、CIN III、宫颈癌）组HPV E6/E7 mRNA阳性率高于CINI-（慢性子宫颈炎、CINI）组，且不同等级宫颈病变的HPV E6/E7 mRNA拷贝数不同，慢性子宫颈炎组拷贝数最低，宫颈癌组拷贝数最高，HPV E6/E7 mRNA水平与组织学病变程度之间存在正相关性。因此在宫颈筛查过程中，HPV E6/E7 mRNA水平越高，更需警惕宫颈病变甚至是宫颈癌的可能。而HPV E6/E7 mRNA和HR-HPV DNA检测相比，对CIN II+的检出率差异无统计学意义，在两种检测结果均阳性的情况下，HPV E6/E7 mRNA拷贝水平就在宫颈病变严重程度的评估和处理方法的指导上具有更重要的意义。

本研究比较HPV E6/E7 mRNA及HR-HPV DNA检测对ASCUS患者CIN II+的预测价值，通过ROC曲线分析，HPV E6/E7 mRNA的最佳临界点为147.965，以最佳临界点为筛选标准时，HPV E6/E7 mRNA预测ASCUS患者CIN II+的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为90.0%、64.2%、54.2%、93.2%。与HR-HPV DNA检测相比，其特异度和阳性预测值均较高，灵敏度、阴性预测值相近。与本研究结果不同，Benevolo等[9]报道，对于ASCUS患者HPV E6/ E7 mRNA检测预测CIN II+的灵敏度低于HR-HPV DNA检测。目前用于检测HPV E6/E7 mRNA水平的方法有核酸序列扩增法（如PCR、NASBA、TMA）和支链DNA信号放大技术，部分市售的试剂仅检测HR-HPV l6、18、31、33、45中E6/E7 mRNA的转录[10]，而本研究所用试剂可检测14种HR-HPV mRNA，故敏感性更高，与HR-HPV DNA检测相比，在有更高特异性的前提下，不降低敏感度。

本研究中有2例HR-HPV DNA阴性，但HPV E6/E7 mRNA阳性者行宫颈活检，病理报告为CIN III。Cattani等[11]使用多聚合PCR对HR-HPV DNA阴性、HPV E6/ E7 mRNA阳性的病例进行复查，可以检测到病毒基因组E6区域的DNA，证明这些病例中仍存在非常低的病毒拷贝。可能是由于特殊的HPV DNA片段整合到宿主基因，整合后的L1基因缺失影响病毒复制，导致低病毒载量，但整合后的恶性表型却能使E6/ E7癌基因持续过表达。因此，RNA比DNA分析能检测出更多临床上的显著感染。2012版ASCCP的宫颈筛查指南提出，ASCUS患者合并HPV阴性时，可暂缓阴道镜检查，根据该处理原则可能会造成部分高级别宫颈病变的漏诊。另外，指南将21～24岁妇女列为特殊人群，认为在该年龄段ASCUS患者的处理中，HPV DNA检测并非最佳方案，即使结果阳性，仍不建议直接行阴道镜检查。本研究中有1例24岁的HPV 16型阳性ASCUS患者，HPV E6/E7 mRNA拷贝数达31 254.57，经患者知情同意后行阴道镜下宫颈活检，病理诊断为CIN II。虽然30岁以下尤其是25岁以下的年轻女性，子宫颈癌的发生率非常低，但随访过程中仍然有可能遗漏高级别宫颈病变。故TCT提示ASCUS的患者，可同时行HPV E6/E7 mRNA检测，以及时筛选出高级别宫颈病变，预防宫颈浸润癌的发生。

目前，国内宫颈筛查主要采用TCT联合HPV DNA检测。但HPV DNA检测对于＜30岁妇女的检测意义不大，因该年龄段妇女常合并HPV感染能自动清除。本研究慢性子宫颈炎患者中有部分病例HR-HPV DNA阳性但未检测到HPV E6/E7 mRNA，这与HPV一过性感染的自然进程相符合。另有6例HR-HPV DNA阳性的CINI、CIN II患者HPV E6/E7 mRNA为阴性，有文献报道大部分CINI可自行逆转，甚至32%的CINI也可自行消退[12]，所以HPV E6/E7 mRNA阴性可能预示着疾病的逆转，但这部分病例仍需严密随访。

综上所述，HPV E6/E7 mRNA检测不仅对ASCUS患者高级别病变具有较高的辨别能力，能更好地筛选出高危人群，为临床医生提供比DNA检测更具有预测价值的检测结果，而且排除可疑或低度病变的能力更强。在宫颈筛查中，尤其是对ASCUS患者行HPV E6/E7 mRNA检测，能有效减少漏诊，也避免了过度检查、治疗给患者带来的痛苦和精神负担。而HPV E6/E7 mRNA在30岁以下妇女中的应用价值，仍需要大样本研究来证实。

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（本文编辑：丁敏娇）

The diagnostic value of human papilloma virus E6/E7 mRNA detection in CINII+

HUANG Lingxiao1, PAN Qionghui1, ZHENG Jianqiong1, ZHU Xueyan1, ZHU Xueqiong2. 1.Department of Obstetrics and Gynecology, the Third Clinical College of Wenzhou Medical University, Wenzhou People’s Hospital, Wenzhou, 325000; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To evaluate the application value of detecting human papilloma virus (HPV) E6/E7 mRNA as a diagnose test for CINII+. Methods: From January to October in 2014, a total of 426 gynecological outpatients, whose TCT≥ASCUS or/and high-risk HPV DNA positive, were found by cervical lesions screening in Wenzhou People’s Hospital. All those outpatients performed HPV E6/E7 mRNA detection and histopathological examination. According to different histological results, samples were divided into 5 groups, the correlation between the expression of HPV E6/E7 mRNA and the severity of cervical lesions were analyzed. The ROC curve was used to assess the predictive value of HPV E6/E7 mRNA for CINII+ of ASCUS. Results: The cervical cancer group had the highest level of HPV E6/E7 mRNA while the chronic cervical inflammation group had the lowest. Spearman rank analysis demonstrated that the severity of cervical lesions was proportional to the expression of HPV E6/E7 mRNA (r=0.549, P＜0.001). For CINII+, there was no significant difference between HPV E6/ E7 mRNA and high-risk HPV DNA in positive rate (x2=0.197, P＞0.05). The ROC curve showed that HPV E6/ E7 mRNA＞147.965 were superior to any other standards to scan CINII+. The sensitivity and negative predictive value of HPV E6/E7 mRNA and HR-HPV DNA in predicting CINII+ of patients with ASCUS showed no statistically significant difference (P＞0.05), while the specificity and positive predictive value showed statistically significant difference (P＜0.05). Conclusion: The copy number of HPV E6/E7 mRNA transcripts is correlated with severe degree of epithelial cervical dysplasia. The specificity and positive predictive value of HPV E6/E7 mRNAdetection are higher than those of HPV DNA for diagnosis of CINII+ in patients with ASCUS, therefore HPV E6/ E7 mRNA detection may be a valuable tool for triage and patient follow-up.

E6/E7 mRNA; human papilloma virus; DNA; cervical lesions

R711.74

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.08.009

2015-02-01

黄凌霄（1984-），女，浙江温州人，住院医师，在职硕士生。

朱雪琼，教授，主任医师，博士生导师，Email：zjwzzxq@163.com。