亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T、A1298C多态性与胃癌的关系

徐昌隆，王建嶂，郑波，曹曙光，吴昊，薛战雄

（温州医科大学附属第二医院 消化内科，浙江 温州 325027）

·论 著·

亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T、A1298C多态性与胃癌的关系

徐昌隆，王建嶂，郑波，曹曙光，吴昊，薛战雄

（温州医科大学附属第二医院 消化内科，浙江 温州 325027）

目的：探讨亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）C677T和A1298C基因多态性与浙江汉族人群胃癌的关系。方法：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RELP）技术，检测112例胃癌患者和218例正常对照者的MTHFR C677T及A1298C基因多态性分布差异。结果：MTHFR C677T的突变等位基因T及变异基因型（CT+TT）频率在胃癌组和对照组之间均无统计学差异（34.82% vs 32.57%和53.57% vs 52.75%，均P＞0.05）。胃癌组MTHFR A1298C突变等位基因C明显高于对照组，差异有统计学意义（21.43% vs 12.39%，P=0.006，0R=1.929，95%CI：1.325～2.873），而2组间突变基因型（AC+CC）频率差异无统计学意义（32.15% vs 36.24%，P＞0.05）。结论：浙江汉族人群MTHFR A1298C突变等位基因C可能与胃癌的易感性有关。

亚甲基四氢叶酸还原酶；基因多态性；胃肿瘤

亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是叶酸代谢途径的关键酶之一。MTHFR基因有两个常见多态，即C677T及A1298C，其基因多态性最常见的改变是677C→T和 1298A→C的突变。这些突变使其编码的MTHFR蛋白热不稳性及酶活性下降，导致总叶酸水平降低，与包括胃癌在内的多种恶性肿瘤的发生有关[1-2]。国内外有较多报道MTHFR基因多态性与胃癌关系的文献[3-4]，但结论颇不一致。本研究运用现代分子生物学实验技术，在浙江汉族人群中探讨MTHFR基因C677T及A1298C两个单核苷酸位点的多态性与胃癌的关系，并分析众多研究结论迥异的可能原因。

1 对象和方法

1.1 研究对象 2011年5月至2014年7月，在温州医科大学附属第二医院消化内科收集112例原发性胃癌患者为胃癌组，经临床、实验室、电子胃镜及病理组织学确诊，其中男74例，女38例，年龄（59.2±12.8）岁。同期在温州医科大学附属第二医院体检中心收集的218例健康体检者为对照组，其中男147例，女71例，年龄（61±13.2）岁。胃癌组和对照组在性别、年龄构成上差异均无统计学意义（均P＞0.05）。以上研究对象均为无血缘关系的浙江汉族人群。所有入选对象均签署知情同意书，研究取得医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取：取空腹静脉血5 mL，EDTA抗凝。采用蛋白酶K消化，苯酚/氯仿/异戊醇法提取全基因组DNA（试剂盒购自上海捷瑞生物有限公司，按照说明书操作）。经DNA定量仪测定后于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 引物设计和合成：参照文献[5-6] 设计引物，MTHFR C677T引物序列：正义链5’-TGAAGGAGAAGGTGT CTGCGGGA-3’，反义链5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’；MTHFR A1298C引物序列：正义链5’-CTTTGGGGAGCTGA AGGACTACTAC-3’，反义链5’-CACTTTGTGACCATTCCGGTT TG-3’。由上海生物工程有限公司合成。

1.2.3 MTHFR C677T、A1298C基因多态性检测：采用限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RELP）PCR法检测MTHFR C677T和A1298C基因多态性。①C677T扩增体系与基 因多态性分析：PCR反应体系50μL，含正反义链引物 （10 pmol/L）各1.5μL，MgCl2（25 mmol/L）3μL，dNTPs（10 mmol/L）2μL，10×buffer 5μL，Taq酶 2.5 U（1 U/μL），模板DNA 2μL（约20～40 ng/μL）， 灭菌双蒸水32.5μL。反应条件：94 ℃预变性5 min； 94 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35个 循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物用Hinf I（MBI Fermentas，USA）37 ℃酶切过夜，再用10%聚丙烯酰 胺凝胶电泳（PAGE）检测。②A1298C扩增体系与基因多态性分析：PCR反应体系25μL，含正反义链引物（10 pmol/L）各1μL，MgCl2（25 mmol/L）2μL，dNTPs（10 mmol/L）1μL，10×buffer 2μL，Taq酶 1 U（1 U/μL），模板DNA 1μL（约20～40 ng/μL），灭菌双蒸水16μL。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35个 循环；72 ℃延伸7 min。扩增产物加Mbo I I（MBI Fermentas，USA）37 ℃酶切过夜，用12% PAGE检测。

1.3 统计学处理方法 所有数据采用SPSS13.0统计软件处理。Hardy-Weinberg平衡规律使用卡方检验，分类变量运用卡方检验或Fisher精确检验，以比值比（OR）及95%可信区间（CI）表示相对危险度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTHFR C677T、A1298C基因位点 MTHFR C677T正常等位基因C对应198 bp 1条带，突变等位基因T为175、23 bp 2条带，其中23 bp条带泳出胶外，故以198 bp为CC基因型，175 bp为TT基因型，CT基因型有198 bp与175 bp 2条片段带，见图1。MTHFR A1298C正常等位基因A对应56、31、30、28和18 bp， 突变等位基因C对应84、31、30和18 bp，电泳时31、30、28和18 bp片段带泳出胶外，故分别判56 bp 为AA型、84 bp为CC型、有56 bp和84 bp 2条片段带为AC型，见图2。上述基因位点的部分PCR产物经测序后作为阳性对照，以辅助判断基因型（上海浦生生物技术有限公司），见图3-4。

图1 MTHFR C677T酶切产物电泳图

图2 MTHFR A1298C酶切产物电泳图

图3 MTHFR C677T测序图

图4 MTHFR A1298C 测序图

2.2 MTHFR C677T基因型和等位基因在胃癌组和对照组的分布 胃癌组和对照组MTHFR C677T基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡规律（P＞0.05），样本具有群体代表性。MTHFR C677T的突变等位基因T及变异基因型（CT+TT）频率在胃癌组和对照组之间差异均无统计学意义（分别为34.82% vs 32.57%，P=0.363，OR=1.106，95%CI：0.763～1.158； 53.57% vs 52.75%，P=0.654，OR=1.033，95%CI：0.812～1.237），见表1。

2.3 MTHFR A1298C基因型和等位基因在胃癌组和对照组中的分布 胃癌组和对照组MTHFR A1298C基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡规律（P＞0.05），样本具有群体代表性。胃癌组MTHFR A1298C突变等位基因C明显高于对照组，差异有统计学意义 （21.43% vs 12.39%，P=0.006，OR=1.929，95%CI：1.325～2.873）。而2组间突变基因型（AC+CC）频率差异无统计学意义（32.15% vs 36.24%，P=0.762，OR=0.834，95%CI：0.786～2.115），见表2。

表1 MTHFR C677T基因多态性在胃癌组和对照组中的分布 n（%）

表2 MTHFR A1298C基因多态性在胃癌组和对照组中的分布 n（%）

3 讨论

MTHFR能催化5，10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸。MTHFR编码基因位于染色体1p36.3，存在多个单核苷酸多态性位点。其中C677T多态性位于MTHFR基因第4外显子，该位点胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T）后，使MTHFR的热不稳定性增加，导致该酶活性降低。A1298C位于MTHFR基因第7外显子，该位点发生A→C突变后，引起MTHFR催化活性降低。体外基因表达研究发现，携带677TT纯合子基因型、1298AC杂合子基因型以及（677CT+1298AC）复合杂合子基因型的个体，其体内MTHFR酶活性分别降低45%，68%和41%[7]。近期有报道，677CT和677TT变异基因型频率较高人群的血清叶酸浓度显著降低[8]。因此，这些突变引起的血浆叶酸水平降低，可通过破坏DNA甲基化、合成和修复发挥致癌作用，增加包括胃癌在内的多种肿瘤发生的危险性。

本研究显示，胃癌组与对照组之间突变基因型（AC+CC）频率差异无统计学意义，而胃癌患者MTHFR A1298C位点突变等位基因C的频率明显高于对照组，提示MTHFR Al298C可能是浙江汉族人群胃癌的易感基因。在相关Meta分析[4，9-10]中，虽均显示胃癌患者与健康对照之间MTHFR A1298C的突变基因型（AC+ CC）频率差异无统计学意义，但其中Lv等[9]和Dong 等[10]还显现两人群间突变等位基因C差异亦无统计学意义，故皆认为A1298C基因多态性与胃癌的发生无关，与本研究的结果有异。本研究显示的MTHFR C677T的突变等位基因T及变异基因型（CT+TT）频 率在胃癌组和对照组之间差异均无统计学意义，与翁玉蓉等[11]的报道相同，可表明MTHFR C677T多态性与胃癌的发生无明显关联。但是与此结论相反的，包括相关Meta分析的报道[1，3，9-10，12]颇多，都明确提示携带MTHFR 677 CT和677 TT基因型以及T等位基因的个体显著增加胃癌的易感性。经查阅文献还发现有与前述皆迥异的报道，如MTHFR C677T和A1298C多态性均与胃癌的发生无关[13]，以及MTHFR 677 TT基因型和MTHFR 1298 CC基因型都能显著降低患癌症风险[14]。

综上，可以看出MTHFR C677T和MTHFR A1298C基因多态性与胃癌易感性关系的结论差异很大，甚至不少是相互矛盾的。由于这些不一致的结果来自不同种族、不同地区、不同方法的独立研究，Meta分析也只是表达了这些相同目的的多个独立研究结果的合并效应量。故诸多研究结果的差异，似可主要归因于种族差异、研究方法不同、地域相异或某些研究还有对象样本量不够大所致。此外，尤其值得考虑的是MTHFR基因突变致癌是通过降低血浆叶酸水平而起作用的，研究对象个体的叶酸状态（包括叶酸摄入，血浆、血细胞和组织的叶酸含量）很有可能是造成上述结果矛盾的重要原因。可能是基于这种想法，新近有研究将叶酸摄入量作为条件来研究MTHFR基因多态性与胃癌的关系，结果表明MTHFR 677 TT突变基因型和高叶酸摄入量对制约胃癌有保护作用[15]。

[1] Xia LZ,Liu Y,Xu XZ,et a1.Methylenetetrahydrofolate re-ductase C677T and A1298C polymorphisms and gastric can-cer susceptibility[J] .World J Gastroenterol,2014,20(32): 11429-11438.

[2] Ekiz F,Ormeci N,Coban S,et al.Association of methylene-tetrahydrofolate reductase C677T-A1298C polymorphisms with risk for esophageal adenocarcinoma,Barrett’s esoph-agus,and reflux esophagitis[J] .Dis Esophagus,2012,25(5): 437-441.

[3] Boccia S,Hung R,Ricciardi G,et al.Meta-and pooled analyses of the methylenetetrahydrofolate reductase C677T and A1298C polymorphisms and gastric cancer risk: a huge-GSEC review[J] .Am J Epidemiol,2008,167(5): 505-516.

[4] 孙良,孙业桓,曹红院,等.亚甲基四氢叶酸还原酶(MTH-FR)基因多态性与胃癌易感性的Meta分析[J] .现代预防医学,2008,35(15): 2846-2849.

[5] Coppedè F,Marini G,Bargagna S,et al.Folate gene poly-morphisms and the risk of Down syndrome pregnancies in young Italian women[J] .Am J Med Genet A,2006,140(10): 1083-1091.

[6] Laraqui A,Allami A,Carrié A,et al.Relation between plasma homocysteine gene polymorphisms of homocysteine metab-olism-related enzymes,and angiographically proven coro-nary artery disease[J] .Eur J Intern Med,2007,18(6): 474-483.

[7] Weisberg IS,Jacques PF,Selhub J,et al.The 1298A→C polymorphism in methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR): in vitro expression and association with homo-cysteine[J] .Atherosclerosis,2001,156(2): 409-415.

[8] Zappacosta B,Graziano M,Persichilli S,et a1.5,10-Methy-lenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T and A1298C polymorphisms: genotype frequency and association with homocysteine and folate levels inmiddle-southern Italian adults[J] .Cell Biochem Funct,2014,32(1): 1-4.

[9] Lv L,Wang P,Sun B,et al.The polymorphism of methy-lenetetrahydrofolate reductase C677T but not A1298C con-tributes to gastric cancer[J] .Tumour Biol,2014,35(1): 227-237.

[10] Dong X,Wu J,Liang P,et al.Methylenetetrahydrofolate re-ductase C677T and A1298C polymorphisms and gastric can-cer: a meta-analysis[J] .Arch Med Res,2010,41(2): 125-133.

[11] 翁玉蓉,房静远,孙丹凤,等.胃癌组织中叶酸水平与代谢酶亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性的关系研究[J] .中华消化杂志,2006,26(1): 26-30.

[12] Song B,Ai J,Kong X,et al.Aberrant DNA Methylation of P16,MGMT,and hMLH1 Genes in Combination with MTHFR C677T Genetic Polymorphism in gastric cancer[J] .Pak J Med Sci,2013,29(6): 1338-1343.

[13] Kim JK,Kim S,Han JH,et al.Polymorphisms of 5,10-meth-ylenetetrahydrofolate reductase and risk of stomach can-cer in a Korean population[J] .Anticancer Res,2005,25(3B): 2249-2252.

[14] Lin J,Zeng RM,Li RN,et al.Aberrant DNA methylation of the P16,MGMT,and hMLH1 genes in combination with the methylenetetrahydrofolate reductase C677T genetic poly-morphism and folate intake in gastric cancer[J] .Genet Mol Res,2014,13(1): 2060-2068.

[15] Chen J,Yuan L,Duan YQ,et al.Impact of methylenetetrahy-drofolate reductase polymorphisms and folate intake on the risk of gastric cancer and their association with Helicobacter pylori infection and tumor site[J] .Genet Mol Res,2014,13 (4): 9718-9726.

（本文编辑：吴健敏）

Relationship between the methylenetetrahydrofolate reductase C677T,A1298C genetic polymorphisms and gastric cancer

XU Changlong,WANG Jianzhang,ZHENG Bo,CAO Shuguang,WU Hao,XUE Zhanxiong.
Department of Gastroenterology,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Objective:To evaluate the association between methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T,A1298C genetic polymorphisms and gastric cancer in Zhejiang Han nationality population.Methods:Select 112 cases of patients with gastric cancer,choose health check-up 218 cases as controls.The genetic polymorphisms of MTHFR (C677T and A1298C) were detected by PCR-RELP method.Results:There were no significant discrepancies of the mutational allele T and variant genotype (CT+TT) frequencies in the MTHFR C677T gene between the gastric cancer patients and the controls (34.82% vs 32.57% and 53.57% vs 52.75%,respectively,all P＞0.05).The frequency of mutational allele C in MTHFR A1298C gene was significantly higher in gastric cancer patients than that in the controls (21.43% vs 12.39%,P=0.006,OR=1.929,95%CI: 1.325～2.873).However,there were no significant discrepancies of the variant genotype frequencies (AC+CC) between the two groups (32.15% vs 36.24%,P＞0.05).Conclusion:The mutational allele C in MTHFR A1298C gene may be associated with the susceptibility to gastric cancer in Zhejiang Han nationality population.

methylenetetrahydrofolate reductase; genetic polymorphism; gastric neoplasms

R735.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.05.005

2015-01-03

温州市科技计划资助项目（Y20110132）

徐昌隆（1976-），男，浙江温州人，副主任医师，博士。

薛战雄，主任医师，Email：xuezhanxiong@163.com。