川崎病血清特异相关miR-23a对人脐静脉内皮细胞生长及迁移的影响

褚茂平，胡晨，周爱华，王慧颖，潘璐璐，仇慧仙，吴蓉洲，赵仙先

（1.第二军医大学附属长海医院 心血管内科，上海 200433；2.温州医科大学附属第一医院 儿童中心，浙江 温州 325015；3.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 儿童心脏中心，温州医科大学 心血 管发育与转化医学研究所，浙江 温州 325027）

·论 著·

川崎病血清特异相关miR-23a对人脐静脉内皮细胞生长及迁移的影响

褚茂平1，胡晨2，周爱华2，王慧颖2，潘璐璐3，仇慧仙3，吴蓉洲3，赵仙先1

（1.第二军医大学附属长海医院 心血管内科，上海 200433；2.温州医科大学附属第一医院 儿童中心，浙江 温州 325015；3.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 儿童心脏中心，温州医科大学 心血 管发育与转化医学研究所，浙江 温州 325027）

目的：探讨川崎病（KD）血清特异相关miR-23a对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）生长及迁移的影响。方法：采用Real-time PCR验证前期筛选获得的川崎病急性期血清特异性表达的miR-23a，生物信息学分析结合炎症细胞因子及受体芯片检测来筛选靶基因；共分4组，miR-23a mimic组、mimic NC组、miR-23a inhibitor组、inhibitor NC组，通过miR-23a模拟物（mimic）及抑制物（inhibitor）的转染调节HUVECs内miR-23a的表达，用CCK-8法检测细胞增殖的变化，用划痕试验和Transwell小室法检测其对细胞迁移的影响。结果：Real-time PCR发现miR-23a在KD急性期患儿血清中表达水平明显高于KD恢复期、正常对照组及发热对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与mimic NC组对比，上调miR-23a表达可促进HUVECs增殖、迁移，差异有统计学意义（P＜0.05）；与inhibitor NC组对比，下调miR-23a表达可抑制HUVECs的增殖、迁移，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：miR-23a在急性期KD患儿血清中表达上调，干预HUVECs内miR-23a表达可影响其增殖和迁移，提示miR-23a异常表达可能参与KD的发生发展。

川崎病；microRNA-23a；人脐静脉内皮细胞；增殖

川崎病（kawasaki disease，KD）又称皮肤黏膜淋巴结综合征，主要发生在5岁以下婴幼儿，是以全身血管炎为主要表现的急性发热出疹性疾病。自日本学者川崎富作于1967年首次报道[1]以来，世界各国均有报道，但以亚裔发病率最高。目前，在我国KD已经取代了风湿热成为后天性心脏病的主要发病原因之一，其中冠状动脉损害（coronary artery lesions，CAL）是KD最严重的并发症，其发病率和耐药率逐年上升[2]，但至今KD的病因和发病机制尚不明确。MicroRNA（miRNA）为长度约22 nt的内源性短链RNA，通过与编码蛋白质mRNA互补结合，沉默其表达，参与调控细胞的增殖、迁移、凋亡等一系列过程[3]。miR-23位于染色体19p13.13，于多种肿瘤组织中表达均上调，且有报道称其与心肌肥厚、肌肉萎缩有关[4]，见表1。其靶基因主要有ETNK1、FUT9、RAB39B、TOP1等，这些靶基因主要与信号转导、DNA复制、物质代谢及核苷酸代谢有关；也有研究表明miR-23a与促炎细胞因子的表达有正相关性。

本研究首先验证了经过Exiqon miRCURY LNA 芯片筛选出KD血清中特异表达的miR-23a在不同疾病中的差异表达情况，通过体外培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells， HUVECs）合成miR-23a mimic/inhibitor转染血管内皮细胞并观察其对细胞增殖、迁移功能的影响，旨在进一步阐明KD血清中特异表达的miR-23a对内皮细胞功能的影响。

1 材料和方法

1.1 一般资料 收集2013年3月至2013年12月在温州医科大学附属育英儿童医院确诊的20例KD急性期患儿（KD组）血清，其中男12例，女8例，年龄＜1岁6例，1～3岁10例，＞3岁4例。入选标准：参照第7版《诸福棠实用儿科学》KD诊断标准。正常对照血标本采集自同时期同医院的健康体检者20例（正常对照组），选择未发现器质性疾病且血液相关实验室检查无异常及年龄、性别与KD患儿相匹配的儿童，其中男12例，女8例，年龄＜1岁6例，1～3岁10例，＞3岁4例。发热对照血标本采集自同时期同医院急性上呼吸道感染的发热患儿20例（发热对照组），未发现器质性疾病且血液相关实验室检查无异常，且年龄、性别与KD患儿均相匹配。血常规检查KD组急性期患儿WBC、CRP和ECR都升高，见表2。

表1 miR-23a简介

表2 KD急性期患儿和对照组血常规比较（n=20，±s）

表2 KD急性期患儿和对照组血常规比较（n=20，±s）

与发热对照组、正常对照组比：aP＜0.05

1.2 材料 细胞株：HUVEC株购自ATCC公司，miR-23a mimics、NC mimics、miR-23a inhibitor，inhibitor NC（上海吉玛制药技术有限公司）；Lipofectamine 2000 Reagent、Troizol LS Reagent （invirtrogen公司）；1640培养基、0.25% EDTA、PBS（GIBCO公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；CCK-8（日本同仁化学公司）；Transwell小室（美国Corning公司）；6孔板、12孔板、24孔板、96孔板（美国Costar公司）；miRNA反转录试剂盒、Real-time PCR试剂（上海楚天生物有限公司）；其他引物均由上海楚天生物有限公司合成，引物序列见表3。

表3 本研究中所用到的引物序列

1.3 方法

1.3.1 分组方法：共分为4组：miR-23a mimic组（转染miR-23a模拟物，浓度为40 nmol/L）、mimic NC对照组（转染NC阴性对照模拟物，浓度为40 nmol/L）、 miR-23a inhibitor组（转染miR-23a抑制物，浓度为40 nmol/L）及inhibitor NC组（转染NC抑制物，浓度为40 nmol/L）。

1.3.2 RNA的提取：将采集的全血标本2 mL置于真空EDTA抗凝管，2 000 r/min， 离心10 min，取上层血清，按Trizol LS试剂说明书抽提样品总RNA，焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水溶解RNA，取RNA溶 液1μL于Nano 2000上检测RNA的浓度和纯度，以OD 260/OD 280比值在1.8～2.2为合格标准，保存于-80 ℃超低温冰箱或立即用于后续实验。

1.3.3 miR-23a表达的验证：采用反转录试剂盒将1 μg总RNA反转录为cDNA。20 μL反应体系：包括4μL 5 X reaction buffer，2μL Enzymemix，14 μL稀释后的总RNA模板。反应条件：42 ℃，60 min， 95 ℃，5 min。以cel-miR-39为外参，采用Real-time PCR进行验证，混合cDNA模板，nucleasefreewater 和SYBRTMGreenmastermix PCR，反应条件为：95 ℃ 预变性10 min（95 ℃变性10 min、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min）×40个循环，溶解曲线：95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，冷却40 ℃ 30 s。采用Biorad CFX96实时荧光定量PCR仪器进行，所有样品3个复孔，记录Ct值（即每个反应管中荧光信号到达所设定阈值时所经历的循环数），采用2-△△CT分析各组间相对表达差异。

1.3.4 CCK-8法检测细胞增殖能力：按CCK-8试剂说明书检测细胞增殖能力，将对数生长期的HUVECs接种于96孔板，采用Lipofectamine 2000转染至细胞内，分别处理12、24、48、72 h后，每孔不同的时间点加入10μL的CCK-8试剂，避光保存置于培养箱2 h后用酶标仪检测OD值（450 nm），实验重复3次。根据下列公式计算：抑制率（%）=（1-实验组OD值/阴性对照OD值）×100%。

1.3.5 细胞划痕实验检测细胞迁移能力：用记号笔在6孔板背后画线，将对数生长期的HUVECs接种于6孔板，垂直于背后的横线划痕，用PBS洗涤细胞去除划下的细胞，加至无血清培养基，采用Lipofectamine 2 000转染至细胞内，按24、48、72 h取 样，倒置显微镜下拍照，实验重复3次。

1.3.6 Transwell小室法检测细胞迁移能力：将对数生长期的HUVECs接种于24孔板，采用Lipofectamine 2 000转染至细胞内，取0.3 mL细胞悬液，加入Transwell小室上室中，下室加入含有50 ng/mL FBS的培养基0.6 mL，置入培养箱中继续培养24 h。 取出Transwell吸去上室细胞，拭去上层底膜上面的细胞，于3%甲醛中固定30 min，0.1%结晶紫染色15 min。显微镜选取4个视野，观察迁移至下层的细胞并进行拍照，计数每个视野的平均细胞量。迁移抑制率（%）=（对照组迁移细胞平均数-转染组迁移细胞平均数）/对照组迁移细胞平均数×100%

1.4 统计学处理方法 采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析。计量资料用±s表示；计数资料用频率（%）表示；计量资料中2组连续性数据间比较采用独立样本t检验；多样本平均数间比较采用单因素方差分析方法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-23a在KD患儿血清中的表达 RT-qPCR产物溶解曲线均单峰，特异性扩增相应的miRNA，见图1。与KD恢复期组、发热对照组、正常对照组相比，KD急性期组血清中miR-23a的表达量明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2。

图1 qPCR验证miR-23a的表达

图2 miR-23a的差异表达

2.2 miR-23a对HUVECs增殖功能的影响 miR-23a mimic和miR-23a inhibitor及mimic NC及inhibitor NC组转染HUVECs 24、48和72 h后，miR-23a mimic可 以促进HUVECs的增殖，与阴性对照（mimic NC）比差 异有统计学意义（P＜0.05）；miR-23a inhibitor可以抑制HUVECs的增殖，与inhibitor NC（Inhibitor NC）比差异有统计学意义（P＜0.05），与miR-23a inhibitor组比，miR-23a mimic组可以促进细胞的增殖（P＜0.05），见表4。

2.3 miR-23a对HUVECs迁移功能的影响 细胞划痕实验和Transwell小室法检测结果显示，miR-23a mimic可以促进HUVECs的迁移，而miR-23a inhibitor 可以减弱HUVECs的迁移，差异有统计学意义（P＜ 0.05），与miR-23a inhibitor组比，miR-23a mimic组可以促进细胞的迁移，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3-5。

表4 miR-23a干预对HUVECs增殖的影响（±s）

表4 miR-23a干预对HUVECs增殖的影响（±s）

与mimic NC组比：aP＜0.05；与inhibitor NC组比：bP＜0.05

图3 miR-23a对HUVECs迁移的影响（划痕实验，结晶紫染色，×200）

图4 miR-23a对HUVECs迁移的影响（Transwell小室法，结晶紫染色，×100）

图5 miR-23a对HUVECs迁移的影响（Transwell小室法）

3 讨论

KD是一种以全身血管炎为主要病变的急性发热、出疹性疾病[2]，多个国家的医学工作者对KD进行了大量的研究，但其病因、机制依然尚不明确。如未对KD作出及时的诊断和治疗，可导致患儿出现缺血性心脏病、心肌梗死及猝死。其主要病理改变为全身非特异性血管炎，病程早期为全身微血管炎，约2周后表现为主动脉分支的动脉内膜炎和动脉周围炎，尤其是冠状动脉多易受累，部分病例在急性期形成动脉瘤。这种血管炎的改变是心血管系统病例损伤的重要基础。组织学研究表明，KD患者冠状动脉血管壁三层均遭到破坏且增生显著，内皮细胞裸露，大量炎症细胞浸润，电镜下可见血管内皮细胞间隙增大、穿孔，血管呈透明变化，这些变化的主要机制是内皮细胞的功能紊乱[10]。目前认为所有的发病机制最后可能归结于冠状动脉及其他中等肌性血管的内皮损害及弹力纤维损伤，导致血管炎的发生，血管壁的破坏，最终发生冠状动脉瘤及其他动脉瘤。血管内皮细胞在循环血液和血管平滑肌细胞之间起着机械屏障作用，也是人体最大且功能活跃的内分泌器官，由于机械屏障作用，它很容易受到机体内外各种理化因素的损伤，同时作为内分泌器官，使受损后的血管内皮细胞内分泌功能失调，导致正常的平衡被打破，从而导致心血管系统的功能障碍。目前对于KD发生发展过程中血管内皮损伤有关的分子事件做了许多研究，Terai等[11]首次利用免疫组织化学的方法在1例死于冠状动脉血栓的患儿心脏标本中发现冠状动脉血管内皮细胞表达了HLA-DR抗原，提示KD急性期冠状动脉内皮细胞激活或受累，徐明国等[12]发现KD患儿循环内皮细胞损伤，陈树宝等[13]提出，在KD中存在血管衰竭现象，包括内皮细胞、平滑肌细胞功能的紊乱及结构的改变，这提示KD患儿存在血管内皮细胞的功能紊乱。

外周血广泛地参与了机体的免疫功能和炎症反应，KD急性期血清能真实、全面地反映KD患儿整体的血管炎症及免疫的功能，而miRNA不编码蛋白质，通过与靶基因mRNA特异性相互作用降解或抑制靶基因的翻译而发挥调控作用，可与靶mRNA3’UTR结合发生相互作用，抑制其翻译或诱导其降解，从而调节靶基因[14]。近年来已确定miRNA在各个生理过程中发挥了重大作用，如在生物发育，脂肪代谢，细胞分化、增殖和凋亡等过程中发挥重要作用[15]，Zhang等[16]和Cordes等[17]都认为miRNAs在血管生成和病变及心血管疾病中发挥重要作用。Shimizu 等[5]首次报道miRNA与KD的相关性之后，2014年Yun 等[6]认为KD患儿血清中miR-200c和miR-371-3p表达是升高的，Rowley等[7]研究了KD患儿冠状动脉中表达的miRNA，Ni等[8]指出急性期miR-155/SOCS1信号通路的激活和miR-31的过表达可能导致了Tregs下降，从而参与KD的发生发展进程，提示循环中的miRNAs可以影响细胞内的mRNA，参与内皮细胞的调节，从而参与KD的发生发展。我们采用Exiqon miRCURY LNA芯片筛选出KD急性期血清中特异性表达miR-23a。miR-23a属于miR-23a/27a/24基因簇，该 基因簇拥有独立的启动子，能够表达3种成熟miRNA： miR-23a、miR-27a、miR-24。该基因簇在许多疾病中表达异常，能够调控细胞的周期、增殖、分化，血细胞生成和心脏肥大等生命过程[9]。对死于冠脉瘤的KD患儿进行病理检查发现，从外膜、血管周围组织逐渐至官腔，呈现成纤维细胞的增殖及不同程度的炎症。

在HUVECs的基础上，研究miR-23a对血管内皮细胞基本生物学功能及分泌功能的影响，并初步探究其机制，分别包括用CCK-8法检测细胞增殖功能、细胞划痕试验和Transwell实验检测细胞迁移功能等，我们发现miR-23a可以促进细胞增殖、细胞迁移。Hashimoto等[18]研究发现，与正常血清组和感染发热组血清相比，KD血清可以促进HUVECs的细胞增殖，认为KD血清促进HUVECs细胞增殖的作用和血清中的某些成分相关，这与miR-23a mimic促进内皮细胞的增殖相一致。本实验采用细胞划痕试验和Transwell实验检测转染miR-23a mimic后内皮细胞的迁移能力，发现miR-23a具有促进内皮细胞迁移的作用，推测miR-23a可通过调节细胞因子从而发挥促进细胞迁移和游走的作用。miRNA通过与靶基因mRNA特异性相互作用降解或抑制靶基因的翻译而发挥调控作用。因此，尚需进一步进行miRNA靶基因的识别和功能研究。

本研究从miRNA的角度出发研究了KD血清中特异相关miR-23a，发现其可以影响内皮细胞的基本生物学功能，造成内皮细胞功能的紊乱，并影响血管内皮细胞分泌功能，从而参与KD发生发展的过程。如果能对miR-23a的作用机制有更进一步的了解，将能更好地阐释KD的发病机制，对其早期诊断及防治提供更好的方向。

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（本文编辑：吴彬）

MicroRNA-23a regulate the growth and migration of HUVECs in Kawasaki disease

CHU Maoping1,HU Chen2,ZHOU Aihua2,WANG Huiying2,PAN Lulu3,QIU Huixian3,WU Rongzhou3,ZHAO Xianxian1.
1.Department of Cardiology,the Affiliated Changhai Hospital of Second Military University,Shanghai,200433; 2.Department of Children’s Center,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 3.Children’s Heart Center,the Second Affiliated Hospital & Yuying Children’s Hospital,Institute of Cardiovascular Development & Translational Medicine,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Objective:To study the effect of miR-23a that on the growth and migration of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) in Kawasaki disease.Methods: Real-time PCR was used to confirme miR-23a that differential expression between Kawasaki disease and controls.Bioinformatics analysis and the gene chip of inflammatory cytokine were used to target the genes.Transfect the miR-23a mimic/inhibitor in HUVECs.CCK-8 assay was used to measure the effect of proliferation.Cell scratch method and transwell chamber were performed to investigate the effect of migration.Results:MiR-23a was significantly higher in Kawasaki disease.The miR-23a mimic could promote the proliferation and migrate of HUVECs,the mi-23a inhibitor could inhibit the proliferation and migrate (P＜0.05).Conclusion:The miR-23a play an important role in the development and progression of KD and could effect the proliferation and migrate of HUVECs.

kawasaki disease; microRNA-23a; human umbilical vein endothelial cells; proliferation

R725.4

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.05.002

2015-02-23

浙江省自然科学基金资助项目（LY12H02003）；浙江省医药卫生科技计划项目（2012ZDA035）。

褚茂平（1969-），男，浙江温州人，主任医师，博士。

赵仙先，主任医师，教授，Email：13601713431@163.com。