阿托伐他汀对低密度脂蛋白受体基因敲除小鼠IL-17a、LP-PLA2表达的影响

倪云杰，林振浩，侯良磊，吴漪皓，宋丽娟，胡欢欢，黄晓燕，杨德业，

（1.温州医科大学附属第一医院 心内科，浙江 温州 325015；2.杭州师范大学附属医院 心内科，浙江 杭州 310015）

·论 著·

阿托伐他汀对低密度脂蛋白受体基因敲除小鼠IL-17a、LP-PLA2表达的影响

倪云杰1，林振浩1，侯良磊1，吴漪皓1，宋丽娟1，胡欢欢1，黄晓燕2，杨德业1，2

（1.温州医科大学附属第一医院 心内科，浙江 温州 325015；2.杭州师范大学附属医院 心内科，浙江 杭州 310015）

目的：探讨阿托伐他汀对低密度脂蛋白受体基因敲除（LDLR-/-）小鼠白介素-17a（IL-17a）、脂蛋白相关磷脂酶A2（LP-PLA2）表达的影响。方法：取18只8周龄雄性LDLR-/-小鼠，12只给予高脂饮食（高脂饮食组）用于建立动脉粥样硬化模型，6只给予普通饮食作为普食对照组。8周后，将高脂饮食小鼠随机分成2组：高脂对照组（n=6）和治疗组（n=6，阿托伐他汀60 mg·kg-1·d-1灌胃），继续给予高脂饮食。8周后处死小鼠，全自动生化仪测血清血脂水平，HE染色观察斑块形态，qRT-PCR测主动脉中IL-17a和LP-PLA2的mRNA表达，免疫组织化学法测斑块中IL-17a的表达，Western blot法测主动脉中LP-PLA2的表达。结果：高脂对照组血清总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）含量均明显高于普食对照组（均P＜0.05），甘油三酯（TG）含量两者差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗组与高脂对照组相比，血清TC、LDL含量明显降低（均P＜0.05），TG含量两者差异无统计学意义（P＞0.05）。高脂对照组小鼠主动脉组织内可见明显动脉粥样硬化斑块形成，斑块内IL-17a的平均吸光度值（MA）高于普食对照组（P＜0.05）。治疗组与高脂对照组相比，斑块明显减少，斑块内IL-17a的MA也明显降低（P＜0.05）。高脂对照组主动脉IL-17a和LP-PLA2的mRNA表达以及LP-PLA2蛋白的表达均高于普食对照组（均P＜0.05）。治疗组与高脂对照组相比，主动脉IL-17a和LP-PLA2的mRNA以及LP-PLA2蛋白的表达均明显降低（均P＜0.05）。结论：阿托伐他汀可降低LDLR-/-小鼠动脉粥样硬化模型中的血脂水平，可有效抑制IL-17a、LP-PLA2的表达，对抗动脉粥样硬化的作用。

动脉粥样硬化；阿托伐他汀；白介素-17a；脂蛋白相关磷脂酶A2

动脉粥样硬化性心脏病是全球范围内最常见和危害最大的疾病之一，在大多数国家里已成为主要死亡原因，在中国，其发病率以及病死率也呈逐年上升的趋势。上世纪90年代Ross等人提出了动脉粥样硬化的慢性炎症学说，炎症参与了动脉粥样硬化的各个过程，包括斑块的起始、形成、硬化发展及斑块从稳定到不稳定的改变[1]。白介素-17a （interleukin-17a，IL-17a）主要由Th17细胞分泌， 可通过诱导巨噬细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细 胞活化，进而释放大量细胞因子（如基质金属蛋白酶等），从而导致板块形成及破裂[2]。脂蛋白相关磷脂酶A2（lipoprotein-associated phospholipase A2，LP-PLA2）是心血管疾病中的一种新的炎症因子，可以通过水解氧化低密度脂蛋白产生溶血磷脂酰胆碱（Lyso-PC）和氧化型游离脂肪酸（ox-FA），促进动脉粥样硬化的形成和发展[3]。本实验采用低密度脂蛋白受体基因敲除（low density lipoprotein receptor knock out，LDLR-/-）小鼠，以高脂饮食建立动脉粥样硬化模型，通过观察阿托伐他汀治疗后斑块内IL-17a以及LP-PLA2改变，进而评价阿托伐他汀对动脉粥样硬化的治疗效果。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF级8周龄雄性LDLR-/-小鼠22只，购自南京大学模式动物研究所[动物生产许可证号SCXK（苏）2005-0002] ，饲养于浙江中医药大学动物中心SPF级动物房；阿托伐他汀（立普妥）由美国辉瑞公司提供；实时定量引物、Trizol试剂、DEPC水（RNase-free and DNase-free）购自美国Invitrogen 公司；反转录试剂盒购自美国Thermo公司；PCR试剂盒（SYBRGreen Realtime PCR Master Mix）、96孔板及封板膜购自ABI公司；小鼠LP-PLA2抗体购自武汉三鹰公司，小鼠IL-17a多克隆抗体、β-actin购自美国Abcam公司；PMSF、RIPA、山羊抗兔抗体、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自江苏海门碧云天试剂公司；ECL化学发光显色试剂盒、PVDF膜购自美国Millipore公司；DAB显色液购自北京中杉金桥；其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 模型的建立与分组 8周龄雄性LDLR-/-小鼠18只，随机分为2组：正常饮食组和高脂饮食组。其中，正常饮食组6只，给予普通饮食；高脂饮食组12只给予高脂饲料（脂肪21%，胆固醇0.15%）。喂养8周后，将12只高脂饮食组小鼠随机分成高脂对照组和治疗组，每组6只。治疗组继续给予高脂饮食并以阿托伐他汀60 mg·kg-1·d-10.9%氯化钠溶液稀释后灌胃；高脂对照组继续给予高脂饮食并以等容量0.9%氯化钠溶液灌胃。剩下的6只正常饮食组小鼠继续给予普通饮食并以等容量0.9%氯化钠溶液灌胃作为普食对照组。

1.3 标本制备和取材 喂养8周后，小鼠禁食禁水8 h。腹腔注射1.5%戊巴比妥钠（0.1 mL/20 g体质量）麻醉，摘眼球取血，分离血清。乙醇消毒皮肤后剖开胸腔，暴露心脏，剪下右心耳，将注射器插入心尖，用高压消毒后预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）20 mL灌流。灌流完毕后分离出整根小鼠主动脉，取主动脉根部于4%多聚甲醛中浸泡24 h，常规石蜡包埋、固定。每只小鼠从主动脉根部连续做4 μm厚度切片，每隔5张取一张用于苏木素-伊红染色（HE）及免疫组织化学染色。其余主动脉分2份于-80 ℃保存。

1.4 血脂测定 通过全自动生化分析仪测血清中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）的表达水平。

1.5 免疫组织化学 取石蜡切片62 ℃烤箱烘烤1 h，常规脱蜡后枸橼酸高压修复3 min，PBS清洗 5 min×3次，0.3%过氧化氢（H2O2）溶液阻断30 min， 5%山羊血清室温封闭30 min，IL-17a抗体（1:500）4 ℃孵育过夜。PBS清洗3次，二抗室温孵育1 h，DAB染色，苏木素核染，水洗，封片。结果判定采用Image Pro Plus 6.0软件进行分析，计算出平均吸光度值（mean absorbance，MA）=累积吸光度值/斑块面积。

1.6 实时荧光定量PCR测LP-PLA2、IL-17a mRNA的表达 通过Trizol提取小鼠主动脉总RNA，用Rever-tAidTM First StrandcDNA Synthesis Kit反转录试 剂盒合成cDNA。以上述cDNA为模板，应用ABI 7900HT Prism实时荧光定量PCR仪进行定量PCR检测。GAPDH引物序列F：5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，R：5’-GG GGTCGTTGATGGCAACA-3’，IL-17a引物序列F：5’-TTTA ACTCCCTTGGCGCAAAA-3’，R：5’-CTTTCCCTCCGCATTGAC AC-3’，LP-PLA2引物序列F：5’-GATCGTACCCCGTCGGT TG-3’，R：5’-GTCGAGGCGACCTTGATCTT-3’；PCR条件：预变性95 ℃ 5 min，（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s）共40个循环。采用GAPDH为内参，进行归一化各组生物学重复3次。数据分析利用美国Biosystems公司的Sequence Detec-tionsystem（SDS）2.4软件进行。样本目的基因的相对表达率（relativeexpression， RQ）采用△△CT方法计算，RQ＝2-△△CT（CT表示PCR 扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数），△CTsample=CTsample-CT/GAPDHsample，△CTcontrol=CTcontrol-CT/GAPDHcontrol，△△CT=△CTsample-△CTcontrol。

1.7 Western blot法测血管中LP-PLA2蛋白的表达

用RIPA裂解液提取主动脉总蛋白，加入SDS-PAGE上样缓冲液（4:1），煮沸变性10 min。每孔上样量为 40μg，用10%的SDS-PAGE凝胶进行电泳，半干转恒压15 V转膜30 min至PVDF膜，TBST洗膜10 min× 3次，5%脱脂奶粉（TBST稀释）室温封闭1.5 h，TBST洗膜10 min×3次，敷一抗[LP-PLA2抗体（1:300），β-actin（1:1 000）] ，4 ℃过夜，洗膜10 min×3次，加羊抗兔二抗（1:5 000）室温孵育1.5 h，TBST洗 膜10 min×3，最后加入ECL底物溶液显色，使用DNR MicroChemi化学发光仪曝光，以β-actin作为内参，标化LP-PLA2蛋白表达，各组生物学重复3次，技术重复3次，以Quantity One软件进行半定量分析。

1.8 统计学处理方法 采用SPSS 17.0软件完成统计学分析。计量资料以±s表示，实验数据经过方差齐性检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，独立的两组间比较用t检验，方差不齐时使用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 全自动生化仪检测血脂结果 高脂对照组小鼠血清TC、LDL含量均高于普食对照组（均P＜0.05），TG含量两者差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗组小鼠在用阿托伐他汀治疗8周后，与高脂对照组小鼠相比，血清TC、LDL含量降低（均P＜0.05），TG含量两者差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1，图1。

表1 各组小鼠血脂水平的比较（n=6，±s，mmol/L）

表1 各组小鼠血脂水平的比较（n=6，±s，mmol/L）

与普食对照组比：aP＜0.05；与高脂对照组比：bP＜0.05

图1 各组小鼠血脂水平的变化

2.2 各组小鼠主动根部切片HE染色结果 HE染色可见普食对照组血管内膜完整，未见粥样斑块生成，未见泡沫细胞、炎症细胞聚集；高脂对照组血管内可见粥样斑块生成，内膜破损，内膜下大量泡沫细胞、炎症细胞聚集，管腔狭窄；治疗组血管内亦可见粥样斑块生成，但与高脂对照组比较，管腔狭窄明显减轻，内膜下泡沫细胞、炎症细胞也明显少于高脂对照组。见图2。

2.3 各组小鼠主动脉根部切片IL-17a免疫组织化学染色结果 免疫组织化学结果可见，普食对照组动脉管腔内没有斑块组织，因而没有IL-17a的阳性表达，高脂对照组主动脉斑块中可见明显的IL-17a阳性表达：MA为0.3468±0.0090；治疗组主动脉斑块中亦可见IL-17a阳性表达：MA为0.1435±0.0108，但是与高脂对照组相比，IL-17a的阳性表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

2.4 qRT-PCR法检测主动脉中LP-PLA2、IL-17a mRNA的表达情况 与空白对照组（1.00±0.00）相比，高脂对照组主动脉LP-PLA2 mRNA的表达（4.35± 0.51），以及IL-17a mRNA的表达（2.30±0.29）明显升高（P＜0.05）；治疗组动脉LP-PLA2 mRNA的表达（1.21±0.11），以及IL-17a mRNA的表达（1.81± 0.24）与高脂对照组相比，则明显降低（P＜0.05）。见图4。

图2 各组小鼠主动脉根部切片HE染色（×100）

图3 各组小鼠主动脉根部切片IL-17a表达（×100）

图4 qRT-PCR检测主动脉LP-PLA2、IL-17a mRNA的表达

2.5 Western blot法检测主动脉中LP-PLA2蛋白表达水平 与空白对照组（1.00±0.00）相比，高脂对照组主动脉LP-PLA2蛋白的表达（1.79±0.34）明显升高（P＜0.05）；治疗组主动脉LP-PLA2蛋白的表达（1.16±0.15），与高脂对照组相比，则明显降低（P

图5 Western blot法测主动脉中LP-PLA2蛋白的表达

3 讨论

他汀类药物能够抑制血管内皮的炎症反应，稳定粥样斑块，改善血管内皮功能，延缓动脉粥样硬化程度，被视为治疗冠状动脉粥样硬化的一线药物。近几年的研究表明，他汀类药物不但具有降低血脂的作用，还能够增加斑块的稳定性，从而预防由斑块破裂引起的急性冠脉综合征。本研究采用LDLR-/-小鼠建立动脉粥样硬化模型，观察阿托伐他汀对于动脉粥样硬化模型小鼠血脂水平、动脉粥样硬化程度以及LP-PLA2和IL-17a表达的影响，阿托伐他汀治疗动脉粥样硬化的机制。结果显示高脂饮食组小鼠TC、LDL均高于普食对照组，而治疗组小鼠TC、LDL水平均低于高脂饮食组。另外，HE染色结果提示阿托伐他汀治疗后的小鼠斑块面积、泡沫细胞以及炎症细胞的数量均明显小于高脂对照组。可见阿托伐他汀不仅可以有效降低血脂水平，也有利于抑制斑块的形成和发展。

Th17细胞是一种新的CD4+T细胞亚型，主要分泌IL-17a因子。近年来，多项研究表明IL-17a在动脉粥样硬化的发生发展中扮演了重要角色[4-5]。研究表明，IL-17a可以促进血管平滑肌细胞分泌基质金属蛋白酶和组织因子，上调黏附分子ICAM-1、VCAM-1 和趋化因子的表达从而促进动脉粥样硬化的发展以及斑块的破裂[6]。余盼攀等[7]在研究大鼠肝星状细胞时发现，IL-17可促进基质金属蛋白酶-9的表达，促进正常的基底膜的降解。基质金属蛋白酶-9可以加速纤维帽中细胞外基质的降解，使纤维帽变得薄弱而易于破裂。本研究中，高脂饮食喂养后，小鼠动脉斑块内IL-17a的表达相对于普通饮食组显著增强，而在应用阿托伐他汀治疗后，小鼠动脉斑块内IL-17a的表达水平明显少于高脂对照组。说明在动脉粥样硬化小鼠模型中IL-17a的表达是上调的，这与之前众多研究相符合。在应用阿托伐他汀治疗后，IL-17a的表达明显下调，进一步证实阿托伐他汀可以通过降低体内IL-17a的表达来达到治疗冠状动脉粥样硬化的作用。

LP-PLA2是磷脂酶A2家族成员，主要由巨噬细胞、单核细胞、T淋巴细胞和肥大细胞分泌产生。人循环中的LP-PLA2主要和脂蛋白颗粒结合，其中2/3 与LDL结合，其余1/3与VLDL和HDL结合[8]。LP-PLA2能够水解氧化低密度脂蛋白（oxLDL），将其水解生成卵磷脂以及氧化游离脂肪酸等促炎递质，后两者可促进细胞黏附因子、表皮生长因子和血小板源性生长因子的表达，引起内皮功能障碍，促进单核细胞向内膜聚集衍生成巨噬细胞，从而促进动脉粥样硬化的发生和发展。大量研究表明，LP-PLA2为血管炎症反应特异性标志物，可以反映粥样斑块的严重程度，而且在急性冠脉综合征患者中，LP-PLA2的水平也显著升高。最新的研究表明，血清LP-PLA2的水平也和支架植入后再狭窄呈正相关[9]。Dohi等[10]通过大量实验证明：在急性冠脉综合征患者中，降低循环中LP-PLA2的水平有利于冠脉斑块的消退。本实验中，通过高脂饮食喂养后，小鼠动脉中LPPLA2的水平相较普食对照组增强，在阿托伐他汀治疗后，LP-PLA2的水平明显降低。这与之前的研究相符合，进一步说明LP-PLA2对与促进动脉粥样硬化的形成和发展存在密切关系；阿托伐他汀可通过下调组织内LP-PLA2的表达来延缓动脉粥样硬化的进展。

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（本文编辑：吴健敏）

Impacts of atorvastatin on expression of IL-17a,LP-PLA2 in low-density lipoprotein receptor knockout mice

NI Yunjie1,LIN Zhenhao1,HOU Lianglei1,WU Yihao1,SONG Lijuan1,HU Huanhuan1,HUANG Xiaoyan2, YANG Deye1,2.
1.Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 2.Department of Cardiology,the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University,Hangzhou,310015

Objective:To investigate the effect of atorvastatin on expression of IL-17a,LP-PLA2 in LDLR-knockout (LDLR-/-) mice.Methods:Eighteen 8-week-old male LDLR-/-mice were raised in six cages.Twelve mice were fed with high fat diet for establishing atherosclerosis model.The other six mice were fed with normal diet which was used as the normal diet control group.After eight weeks,mice fed with high fat diet were divided into high fat diet control group (n=6) and atorvastatin group (n=6,60 mg·kg-1·d-1per gavage).The other six mice fed with normal diet which was used as normal diet control group and continued to feed normal diet.All mice were sacrificed after eight weeks.Automatic Biochemical Analyzer was performed to measure serum lipid levels.Hematoxylin and eosin (HE) staining was used to observe the morphology of plaque.qRT-PCR was performed to analyze the level of expression of IL-17a mRNA and LP-PLA2 mRNA.Immunohistochemistry was performed to analyze the expression of protein IL-17a.Western blot was performed to analyze the expression of protein LP-PLA2.Results:Serum cholesterol (TC) and low density lipoprotein (LDL) levels were significantly higher in high fat diet control group than that in normal diet control group (both P＜0.05),while there were no significantly difference of triglyceride (TG) level between two groups (P＞0.05).TC and LDL levels of Atorvastatingroup compared with the high fat control group were significantly reduced (P＜0.05).Also,there were no significantly difference of TG level between two groups (P＞0.05).Obviously,Atherosclerosis lesion area was observed in high fat diet control group,while there was no atherosclerosis lesion observed in normal diet control group.The expression of IL-17a (both protein and mRNA) and LP-PLA2 (both protein and mRNA) in high fat diet control group was significantly up-regulated than that in the normal diet control group (all P＜0.05).Compared with the high fat control group,atherosclerosis lesion area of the atorvastatin group was significantly decreased,and the expression of IL-17a (both protein and mRNA) and LP-PLA2 (both protein and mRNA) was significantly lower (all P＜0.05).Conclusion:Atorvastatin can contribute to anti-atherosclerosis by inhibiting the expression of IL-17a and LP-PLA2,reducing inflammation in LDLR-/-mice fed with high fat diet.

atherosclerosis; atorvastatin; IL-17a; LP-PLA2

R541

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.05.003

2014-12-18

国家自然科学基金资助项目（81270230）。

倪云杰（1988-），男，浙江杭州人，硕士生。

杨德业，教授，博士生导师，Email：deyeyang@126.com。