CD82介导的人类甲状腺癌细胞株FTC-133的生物学特性

陈周浔，周宏众，Henning Dralle，Cuong Hoang-Vu

（1．温州医科大学附属第一医院 胃肠外科，浙江 温州 325015；2．德国Martin-Luther-University Halle-Wittenberg 普通、内脏、血管外科中心外科，外科肿瘤与实验研究组，德国 哈雷 06102）

·论 著·

CD82介导的人类甲状腺癌细胞株FTC-133的生物学特性

陈周浔1，周宏众1，Henning Dralle2，Cuong Hoang-Vu2

（1．温州医科大学附属第一医院 胃肠外科，浙江 温州 325015；2．德国Martin-Luther-University Halle-Wittenberg 普通、内脏、血管外科中心外科，外科肿瘤与实验研究组，德国 哈雷 06102）

目的：探讨肿瘤转移抑制因子CD82在调控人甲状腺癌细胞侵润和迁移中的作用以及发挥作用的相关分子机制。方法：采用基因工程技术，将含CD82全长基因的pCDNA3.1质粒用于细胞转染，构建过表达CD82基因的FTC-133细胞株，并将其与野型FTC-133细胞株进行生物性状比对。利用MTT法及Transwell细胞迁移实验检测CD82对FTC-133细胞侵润和迁移能力的影响。结果：与野生型或者空质粒转染细胞相比，各转染细胞（clone 1、2、3）在转染后24、48及72 h的增殖率减少（P＞0.05）；与野生型或者空质粒转染细胞相比，各转染细胞（clone 1、2、3）在转染后24、48及72 h的迁移能力明显减少（P＜0.05）。结论：CD82可以明显降低FTC-133细胞的增殖及侵袭能力，与甲状腺癌发展与进程密切相关。

肿瘤转移抑制因子；CD82；侵润；迁移；甲状腺肿瘤；FTC-133

浙江省2007-2011年甲状腺癌报告发病率为8.37/10万；甲状腺癌的病死率为0.34/10万。温州沿海地区是本病的高发区，2007-2011年甲状腺癌发病率每年以29.95%的速度呈快速上升趋势[1]。目前认为，甲状腺癌的发生是肿瘤性甲状腺细胞发生转移进而引起具有不完全特性的连续基因序列异常的结果。尽管现在对甲状腺肿瘤有大量新的认识，甲状腺癌的去分化线性模型仍未被完全识别。很多患者在诊断时，就被发现体内癌细胞发生了局部转移或者远处转移，90%的转移发生在术后5年内并伴有不理想的预后。甲状腺癌临床早期诊断的方法十分有限，同时存在治疗过度的现象，使得许多甲状腺良性病变患者遭受不必要的手术创伤。因此，临床上需要探索更为敏感可靠的诊断方法或肿瘤标志物以便做出早期诊断。目前已知甲状腺癌的特异蛋白相对较少，需要寻找更多与病变相关的特异蛋白质，并探讨其在甲状腺癌中的作用及其机制。CD82在内的TM4超家族由超过20余种依附在细胞表面的糖蛋白组成，其成员在细胞信号传导、迁移、增殖以及在肿瘤转移形成的过程中起到重要的作用。目前可确定CD82在许多肿瘤的发生发展及转移中有重要作用，关于CD82在甲状腺癌细胞中的意义及相关环节的调控因子及机制的研究，本研究组最早进行过详细报道[2]，本研究意在通过稳定转染手段提高甲状腺滤泡样癌细胞FTC-133的内源性CD82，将转染细胞与野型细胞做全面生物学性状比较，旨在调查CD82与甲状腺癌去分化、侵袭及转移潜力的相关性。

1 材料和方法

1.1 基因重组及转染 运用pCDNA3.1质粒进行构建带人类全长CD82-cDNA序列的真核表达质粒pcDNA-CD82。CD82完整cDNA编码序列（引物序列Forward：5’-CCTGCTGCTGTGTGGACGA-3’，Reverse：5’-GCACTGGT TTCGTGGAAGGA-3’）在一种真核表达载体pCDNA3.1内（Invitrogen公司提供）被亚克隆。脂质体2000（由Invitrogen公司，加州，卡尔斯巴德），Genetecin （G418抗体，GIBCO/Invitrogen）用于转染与筛选。Genetecin实验3周后，获得在6孔板中进行培养的存活细胞。挑取单个抗性细胞克隆在Geneticin （G418）下常规培养扩增，得到高表达CD82的甲状腺癌细胞克隆。

1.2 Western blotting法 参照《分子克隆》中的实验方法，以β-actin的水平作为等量蛋白质样本的内对照，每个标本至少重复3次进行SDS-PAGE电泳，并转至硝酸纤维素膜上，室温封闭2 h后，用TBST缓冲液漂洗3次，再加入抗人抗体，4 ℃孵育过夜。TBST缓冲液漂洗3次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗，室温摇床孵育1 h，增强化学发光系统显色，暗室内X线底片感光成像。

1.3 细胞增殖实验（MTT） 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，铺板使待测细胞调密度至1 000～10 000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。5% CO2，37 ℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），5% CO2以及37 ℃孵育16～48 h，倒置显微镜下观察。每孔加入20μL MTT溶液（5 mg/mL， 即0.5% MTT），继续培养。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲洗2～3遍后，再加入含MTT的培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490 nm处测量各孔的吸光值。设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）和对照孔 （细胞、相同浓度的药物溶解递质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。

1.4 细胞迁移实验 采用Corning公司8μm孔径的聚碳酯膜Transwell小室（24孔板）。在Transwell小室的下室中预先加入600μL 20% FCS的1640培养基，37 ℃平衡1 h，将细胞用PBS洗3次。胰酶消化后重悬于含10%的DMEM Ham’s（1:1）培养基中，取1×106/mL细胞100μL加入至Transwell上室。分别在37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。取出Transwell 小室，从上室用棉棒擦净未穿透微孔滤膜的细胞。PBS冲洗后用4%甲醛固定，行Giemsa染色在200倍显微镜下计数滤膜下表面的细胞数，随机计数5个视野中的细胞数目，每个标本重复3次。以迁移细胞的数目（取实验平均值）来表示细胞的迁移能力。

1.5 统计学处理方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。数据以±s表示，独立样本采用t检验，实验组间比较采用单因素分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FTC-133稳定转染下的CD82过度表达 通过使用RT-PCR实验、蛋白质印迹实验分析在细胞株FTC-133上的CD82转染是否成功。筛选后3个月，我们分离了细胞内的总mRNA并采用RT-PCR证实表达。如图1中转染细胞克隆1（clone1）、克隆2（clone2）、克隆3（clone3）所示，各克隆CD82 mRNA表达水平如图2所示，结果证实：转染细胞内CD82 mRNA （clone1、clone2、clone3）相比野生型FTC-133（WT）以及空载质粒转染细胞（mock）表达明显。转染筛选后3个月，我们分离提纯各细胞的蛋白，并实施蛋白质印迹实验，各克隆CD82蛋白质表达水平如图2所示，结果证实：转染细胞内CD82（clone1、clone2、clone3）蛋白质相比WT以及mock表达明显。

图1 各细胞株的CD82 RT-PCR转录结果

图2 各细胞株的CD82蛋白质印迹实验

2.2 免疫荧光实验 CD82蛋白在细胞内外表达分布如图3所示：在CD82转染克隆FTC-133细胞的细胞膜与细胞质，CD82的免疫荧光染色显示为强反应；野生型FTC-133的CD82免疫反应呈弱阳性或者呈阴性。细胞间的紧密接触处也正是CD82强表达位点（图中白色箭头所指）。

2.3 高表达的CD82对细胞增殖率的影响 MTT测试用于对比野生型FTC-133与CD82转染FTC-133的增殖率。图4所示为CD82转染细胞在转染后的24、48、72 h与WT及mock进行对比监控，可见各转染克隆细胞增殖率减少，但此差异并无统计学意义（P＞0.05）。

图3 免疫荧光实验观察CD82蛋白在细胞内外表达分布（×200）

图4 MTT法测定各细胞的增殖率

2.4 高表达CD82明显抑制细胞的侵润和迁移能力 使用改良的Transwell小室法，来对比野生型FTC-133细胞与CD82转染细胞的细胞运动迁及侵袭能力。结果（见图5）显示，过表达CD82以后，转染后的各时间点（24、48、72 h）的CD82高表达FTC-133细胞相比WT及moke的侵润和迁移能力均明显受到抑制，且各组差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图5 Transwell法确定细胞在转染后24、48、72 h内的迁移细胞数

3 讨论

在以前的课题研究工作中，我们调查了CD82在甲状腺组织中的表达并分析了肿瘤患者病程中的预后指标意义及肿瘤转移的趋势。除了根据组织学和肿瘤发展阶段所规定的肿瘤特性外，每位患者的完整病史也可以说明一些相关的预后指征。将表达的结果进行统计学处理和比较，并分析其变化与各项临床病理学指标的关系，结果显示CD82在所有良性甲状腺肿组织中均呈高表达状态，而在无转移性原发甲状腺癌中只有部分呈高或中度表达（转录水平为66.7%；蛋白水平为58.0%），在转移性原发癌组织中呈弱或无表达。CD82的表达与肿瘤区域淋巴结转移（N）、远处转移（M），以及与分化型甲状腺癌（FTC、PTC）肿瘤分期呈密切相关，且差异均具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.001）。而与患者年龄、性别、癌肿大小（T）则无显著相关性[2]。基于此结果，我们想进一步在细胞模型中对CD82进行功能研究。

CD82也可称为KA11，IA4，C33或者R2，位于人类染色体11p11.2[3]。CD82是种糖基质，属于I I I型跨膜蛋白，并含有2种不同的细胞外环，较大的循环包含3种N-糖基化位点。N-和C-Terminus定位于细胞质中[4]。CD82在细胞膜上的结构与特殊位置使其在细胞信号传导方面的作用非常关键，并可能调控细胞的生长、分化、细胞间黏合及运动[5-7]。CD82可与很多细胞膜表面分子结合，如TM4的其他成员、黏合素因子以及部分在细胞外基质黏合过程中充当重要成分的人类淋巴细胞抗原成分[8-9]。CD82可以与整合素和其他的家族成员相互作用调控细胞间的黏附与转导。它们形成的复合物可以介导细胞间的信号通路广泛的调控细胞的增殖、激活和运动[10-13]。 按黏附分子的结构特点可将其分为以下4类：①黏合素家族的黏附分子；②免疫球蛋白超家族的黏附 分子；③凝集素家族；④钙离子依赖的细胞黏附素 家族的黏附分子，或称Cadherin。TM4与黏合素家族成员之间的相互作用非常密切[14-15]。黏合素是一种黏合蛋白，具有调节细胞基质之间、细胞与细胞之间的相互作用。依赖于黏合素的细胞间的相互黏合是基于细胞信号传导和细胞骨架重组的整合。PKC-TM4SF黏合素结构有可能指示一种新型的信号复合体的产生。在耦合分子TM4SF蛋白质影响下，PKC与特定的黏合素相互绑定。这种绑定很可能发生于TM4SF蛋白质的大环状结构功能区与黏合素的“跟踪区”之间，而PKC则与存在于细胞等离子一区和二区之间的TM4SF蛋白质，或者细胞等离子端的TM4SF蛋白质绑定。这就是说，黏合素的黏合功能是受TM4SF蛋白质调控，而且黏合素与TM4SF的绑定也由于这种交叉作用在细胞表面趋于稳定[3，16]。另有报道称这种新型的信号复合体存在于正常细胞中，在肿瘤组织中无法被检测出来。黏合素包含了细胞内信号级联，黏着斑激素酶（FAK）的络氨酸磷酸化并参与了对钙阳离子的调控[17]。基于目前对TM4SF与黏合素相互作用的研究，TM4SF蛋白质在FAK络氨酸磷酸化过程中，在调节细胞以及重组细胞骨架内的肌动蛋白（也包括转移与非转移）的过程中起到决定性作用[18]。通过体外构建外植体培养模型，我们的结果进一步证实了调高内源性CD82将会显著地抑制甲状腺癌细胞的增殖与迁移能力，在免疫荧光实验中我们可以清楚看到CD82在胞浆及胞外基质的分布情况，其黏附能力抑或与胞外基质中的各种黏附因子，如黏合素以及金属蛋白酶等分子有关。CD82在细胞侵润的下游信号和机制应该和MMPs的表达相关[19-20]，MMPs在降解细胞外基质促进细胞运动中发挥重要作用。在MMP家族的众多成员中，MMP-2和MMP-9在细胞侵润过程中是被研究最多且发挥最大作用的因子。有报道称MMP-9活性受到抑制是通过TIMP-1的表达上调造成的，而且这一过程抑制了肿瘤的侵润[21]。综合本研究结果，我们认为检测CD82可作为甲状腺癌转移潜能的指标，是其恶性转变的重要促进因素，从而进一步证实CD82在甲状腺癌的发生、发展中发挥重要作用。本研究组预备下一步运用蛋白质组学研究方法，利用各种功能蛋白质的分子量及等电点差异，分离纯化、分析目标蛋白质，筛选、分离、鉴定，从蛋白质功能层面调查受CD82影响的各主要相关功能因子。

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（本文编辑：胡苗苗）

The analysis of biological characristics of CD82 mediated human thyroid carcinoma FTC-133 cells

CHEN Zhouxun1,ZHOU Hongzhong1,Henning Dralle2,Cuong Hoang-Vu2.
1.Department of Gastrointestinal Surgery,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 2.Research Group of Experimental and Surgical Oncology,Department of General,Visceral and Vascular Surgery,Martin Luther University Halle-Wittenberg,D-06097 Halle,Germany,06102

Objective:To study the role of tumor suppressor gene CD82 in the regulation of thyroid carcinoma cell invasion/migration and its related molecular mechanisms.Methods:By using genetic engineering technology,the plasmid pCDNA3.1,which reconsturcted with the full length CD82 gene,was transfected into the thyroid carcinoma FTC-133 cells.By MTT and Transwell Assays,the proliferation rate and migration ability of these high expressed CD82 FTC-133 cells were compared with the wild-type cells FTC-133 cells.Results:24,48,72 hours after transfection,the transfected cells showed reduced proliferation rate (P＞0.05) and significant lower migration ability (P＜0.05) in comparison with the wild-type cells and mock cells (trasfected with empty plasmid).Conclusion:These results illustrate that CD82 can reduce FTC-133 cell proliferation and invasiveness,CD82 is closely related to development and progression of thyroid carcinoma.

tumor suppressor gene; CD82; invasiveness; migration; thyroid carcinoma; FTC-133

R135.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.05.007

2015-02-06

温州市科技局科研基金资助项目（2014Y0195）。

陈周浔（1974-），男，浙江温州人，主治医师，博士后。