三个携带线粒体DNA tRNAGln4363T＞C突变的中国汉族原发性高血压家系临床及遗传特征分析

于涵，耿军伟，林枝，薛凌，唐霄雯，郑斌娇，吕建新，卢中秋，管敏鑫，3

（1.温州医科大学 Attardi线粒体生物医学研究院，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属第一医院 急诊科，浙江 温州 325015；3.浙江大学 遗传研究所，浙江 杭州 310058）

·论 著·

三个携带线粒体DNA tRNAGln4363T＞C突变的中国汉族原发性高血压家系临床及遗传特征分析

于涵1，耿军伟1，林枝1，薛凌1，唐霄雯1，郑斌娇1，吕建新1，卢中秋2，管敏鑫1，3

（1.温州医科大学 Attardi线粒体生物医学研究院，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属第一医院 急诊科，浙江 温州 325015；3.浙江大学 遗传研究所，浙江 杭州 310058）

目的：通过对3个携带tRNAGln4363T＞C突变的原发性高血压家系进行临床、遗传和分子特征分析评估，探讨线粒体tRNAGln4363T＞C突变在母系遗传原发性高血压发生发展中的作用。方法：PCR扩增848例原发性高血压患者和254例正常对照样本线粒体tRNA基因，对携带tRNAGln4363T＞C突变的3个家系进行家系及线粒体基因相关分析。结果：共发现3例患者携带tRNAGln4363T＞C突变，突变率为0.35%，患者家系中共有母系成员28位，其中12位患有不同程度的高血压，发病年龄从27到64岁，平均发病年龄为44岁，有1位非母系成员患病，母系成员中男性患者的后代均未表现出发病。3位先证者的线粒体基因全序列分析结果显示，除同质性tRNAGln4363T＞C突变外，还有64个多态性位点，分别属于东亚线粒体单体型Z3、Z3和B4d。tRNAGln4363T位点在进化上高度保守，该位点对应tRNAGln二级结构反密码子环的A38位，tRNAGln4363T＞C突变可能影响此位点与反密码子识别功能的高保真性和正常tRNA结构的形成及结构的稳定性。结论：3个携带tRNAGln4363T＞C突变的中国汉族原发性高血压家系母系遗传特征明显，线粒体tRNAGln4363T ＞C突变可能是这3个原发性高血压家系发病的主要分子基础。3个携带线粒体tRNAGln4363T＞C突变的原发性高血压家系表现出的同质性突变、发病年龄及外显率不同等表型差异特征提示核修饰基因、环境因素和线粒体遗传背景等可能对tRNAGln4363T＞C突变家系原发性高血压的表型表达有一定的影响。

原发性高血压；线粒体DNA；tRNAGln；基因突变；汉族

原发性高血压（essential hypertension，EH）是一种原因不明、以动脉血压升高为主要临床表现的复杂性疾病，是严重的公共健康问题，高血压中90%～95%为EH[1]。EH是一种由多因素引发的复杂性疾病，其发病机制尚未完全明确。EH的发病被普遍认为是遗传与环境因素共同作用的结果[2]，近年来发现，越来越多的EH家系存在母系遗传特征，提示线粒体基因与核基因共同参与了EH的发生发展[3-5]。 线粒体tRNA基因突变是与疾病相关的突变热点区域，已报道的与EH相关的线粒体tRNA突变有tRNAMet4435A＞G[6-7]、tRNAMet/tRNAGln4401A＞G[8]、tRNAGln4353T＞C[9]、tRNAThr15927G＞A[10]突变等[11]，所涉及的位点在进化上大多高度保守，这些突变可能改变了线粒体tRNA的结构和功能，从而影响蛋白质合成，造成氧化磷酸化缺陷，降低ATP的合成，增加活性氧的产生[12]，而脑、心等高能量代谢脏器对ATP的依赖程度很高，如果线粒体功能缺陷，将会影响这些脏器功能，可能诱发EH等多种疾病[13-15]。 因此，本研究对848例EH患者进行线粒体tRNA基因的突变筛查，分析后发现了35个变异位点，通过计算254例正常对照者的等位基因频率、预测二级结构和种系发生分析对这些变异位点进行初步评估，发现tRNAGln4363T＞C突变可能是与疾病相关的致病突变；进一步研究发现有3例无亲缘关系的EH患者携带此突变。为了进一步分析tRNAGln4363T ＞C突变对EH的影响，本研究对家系先证者和家系成员进行了临床资料调查和分子遗传学分析，探讨tRNAGln4363T＞C突变在EH中的作用。

1 对象和方法

1.1 研究对象 848例EH患者中692例来自温州医科大学附属第一医院急诊科、心内科的住院和门诊患者，156例来自体检中心的患者；同时收集同一地区血压正常，无高血压家族史的正常对照254例，均来自温州医科大学附属第一医院体检中心。本研究对EH患者中的3个家系进行研究，先证者及其家系成员均居住在温州地区。按照温州医科大学伦理委员会管理规定的方法得到受访者的知情同意并签署知情同意书。对家系成员的一般情况和血压进行测量和调查，采血进行常规和生化检测。

1.2 临床检查 对家系成员进行一般情况调查、体格检查和心血管疾病危险因子等实验室指标检 查[16]。一般情况调查包括对性别、年龄、民族、身高、体质量及环境因素包括吸烟、饮酒、饮食等进行详细询问，以及有无高血压病史、发病年龄、是否用药治疗、患者的用药时间、用药剂量、是否伴随其他症状等情况调查。血压测量采用间接测量法，第一和第五柯氏音分别指示收缩压和舒张压，测量血压前静坐5 min，安静状态下测量3次取平均值，对于血压≥140/90 mmHg或者服用降压药的患者诊断为高血压[17]。采用心电图评估心脏功能，对家系成员在知情同意后采血进行生化检查，包括血糖、血脂、肝、肾功能以及电解质等。

1.3 线粒体基因组突变分析

1.3.1 全基因组DNA提取：抽取家系成员外周静脉血2 mL于EDTA抗凝管中，采用DNA提取试剂盒（Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 4.0，Takara）进行全基因组DNA提取，-20 ℃保存备用。

1.3.2 线粒体全序扩增：以提取的DNA为模板，采用24对重叠引物特异性PCR扩增线粒体全序[18]，产物纯化后测序，所得结果用Codoncode Aliger软件与人类线粒体DNA标准剑桥序列（Genbank，NC_ 012920）进行比对，分析其中突变位点，同时，对家系其他成员和254例正常对照进行线粒体tRNAGln基因PCR扩增，测序并分析，方法同上。

1.3.3 种系发生学分析：采用人、鼠、牛、爪蟾4个物种线粒体DNA全序列进行初步分析，17个灵长类物种进行进一步分析。将线粒体DNA全序进行种间比对分析，保守性指数（conservation index，CI）通过将人的核苷酸变异与其他16种灵长类物种的该位点进行比对计算得出，即相应位点核苷酸为野生型的物种个数占17个物种数的百分比，如果该值不小于75%说明该位点在进化上是保守的。

1.3.4 东亚单体型分析：根据东亚线粒体单体型树对先证者线粒体全基因组的测序结果进行单体型分型，以探讨在相同单体型的情况下是否存在EH表型的差异[19]。

2 结果

2.1 临床及遗传学评估 WHP12家系来自温州市平阳县，先证者（I I-1），69岁男性患者，高血压病史5年，血压175/76 mmHg，长期服药；无吸烟史，30年饮酒史；血常规及生化检测结果正常；心电图示左心室高电压，T波改变。其弟I I-3，65岁，血压150/90 mmHg；其他家系成员血压正常，也无其他疾病，详见表1-2。此家系共有母系成员6位，1位死亡，2位患高血压，平均发病年龄为64岁，此家系母系成员高血压发病率为33.3%，非母系成员的发病率为0%。WHP13家系来自温州市平阳县，先证者（I I-2），45岁女性患者。高血压病史5年，血压为160/90 mmHg；无吸烟饮酒史；血常规及生化检查结果均正常；心电图正常。其1弟、1妹及3个儿子均患有高血压，无其他疾病，详见表1-2。此家系共有母系成员11位，1位死亡，7位患有高血压，平均发病年龄为33.5岁，此家系母系成员高血压发病率为63.6%，非母系成员的发病率为16.7%。

WHP14家系来自温州市永嘉县，先证者（I I-2），45岁女性患者。高血压病史2年，血压值为140/110 mmHg；无吸烟饮酒史；血常规及生化检查结果均正常；心电图正常。其母亲（I-2），72岁，患有高血压30余年，血压值150/85 mmHg，有糖尿病史，血糖偏高，其他检查均正常；另有一妹患有高血压；其余家系成员无高血压病史，详见表1-2。此家系共有母系成员10位，3位患有高血压，平均发病年龄42岁，母系成员高血压发病率为30%，非母系成员的发病率为0%。

2.2 线粒体基因分析 为进一步分析线粒体背景 对EH外显率和表现度的影响，本研究对WHP12、WHP13 和WHP14 3个家系先证者进行了线粒体全基因组的 扩增和测序，并将测序结果和修正的人类线粒体DNA 标准剑桥序列（Genbank，NC_012920）比对[20]，发现3个无亲缘关系的先证者同时携带tRNAGln4363T ＞C突变，且该位点在17个灵长类物种中保守性为76.5%[21]。这3个mtDNA序列都存在许多变异位点（见表3）：D-Loop区的19个已报道的多态性位点，无功能意义；12S rRNA基因区3个，16S rRNA基因区3个， 以及tRNAThr15930G＞A和tRNAPhe596T＞C突变，均为报道过的多态性位点；在13个多肽编码区存在37个突变位点，包括同义突变25个，错义突变12个（http://www.mitomap.org or http://www.genpat.uu.se/mtDB）。这些错义突变分别为：ND1基因3394T＞C（30Y＞H），ND2基因5263C＞T（265A＞V），ATP6基因8584G＞A（20A＞T）、8701A＞G（59T＞A）、8860A＞G（112T＞A），ND3基因10398A＞G（114T＞A），ND5基因12361A＞G（9T＞A）、12362C＞T（9T＞A）和13942A＞G（536T＞A），Cytb基因14766C＞T（7I ＞T）、15308A＞G（98I＞V）、15326A＞G（194T＞A）。将上述位点进行17个灵长类物种保守性分析，发现除ND1基因3394位点外，其余位点均不保守。将以上位点进行单体型分析，WHP12、WHP13、WHP14家系分别属于东亚线粒体单体型Z3、Z3和B4d[19]。

表1 3个家系先证者临床资料汇总

表2 3个家系成员临床资料汇总

WHP13家系先证者I I-2携带的同质性ND1 3394T ＞C突变在17个物种进化上高度保守，使ND1第30位氨基酸由酪氨酸变为组氨酸，有报道显示其与多种疾病相关[22]。家系分析发现WHP13家系母系成员EH发病率远高于另外2个家系，且临床特征较另外2个家系有所不同，因此ND1 3394T＞C突变可能与tRNAGln4363T＞C突变共同作用影响该家系EH表型的表达。

线粒体tRNAGln为重链编码tRNA，4363T相对应于tRNAGln二级结构反密码子环的A38位置，其在17种灵长类及鼠[23]、牛[24]和爪蟾等20个物种中是高度保守的。Wong等[25]在发育迟缓、胃肠反流、视网 膜炎发育不良和感音神经性耳聋女性儿童患者中发现了此突变，并证实4363T＞C是一个同质性突变。本研究在3个EH家系中都发现了此突变，提示tRNAGln4363T＞C突变可能与EH相关。目前报道的发生在线粒体tRNA二级结构38位上的致病性突变包括tRNAAsn5692A＞G[26]、tRNASer（UCN）7480A＞G[27]和tRNAThr15923A＞G[28]突变等。tRNA 38位置是反密码子环邻近反密码子茎的最后一个碱基。二级结构预测中上述致病性突变通过与相对应的32位形成W-C碱基配对，延长反密码子茎缩小反密码子环，破坏tRNA合成酶识别和密码子的配对，造成tRNA功能障碍，降低线粒体蛋白合成率引起线粒体功能障碍，引起疾病产生。tRNAGln4363T＞C突变可能对反密码子识别的高保真性产生影响，从而参与疾病的发生。

图1 3个携带tRNAGln4363T＞C突变家系图（黑色填充表示EH患者，箭头所指为先证者）

图2 tRNAGln4363T＞C突变鉴定

表3 3个先证者线粒体基因全序分析表

续表3

续表3

3 讨论

通过家系调查发现，这些患者的生活环境和生活方式不同，没有血缘关系，却有EH这一唯一共同的临床特征。EH发病年龄和病情严重程度在各家系 及家系成员间存在差别，母系成员的发病年龄从27 到64岁不等，平均发病年龄为44岁。3个家系的EH发 病具有以下特征：①外显率：WHP12、WHP13和WHP14 家系母系成员的外显率分别为33.3%、63.6%和30%。WHP13家系外显率明显高于WHP12和WHP14。②发病年龄：WHP12家系第I I I代无母系成员，第I I代母系成员的平均发病年龄为64岁。WHP13家系中第I I、第I I I代母系成员的平均发病年龄为40和27岁，平均发病年龄为33.5岁，第I I I代发病年龄明显提前，低于平均发病年龄。WHP14家系中第I、I I代发病年龄分别为40和44岁，第I I I代均未发病。③血压情况：3个家系的平均血压值分别为162.5/83 mmHg、152.5/84 mmHg和145/97.5 mmHg，血压严重情况在3个家系间差异不明显。

EH在这3个家系中呈母系遗传，且分子遗传学分析发现他们拥有一个共同的分子基础即mtDNA tRNAGln4363T＞C突变。此突变在254例正常对照者中出现的频率为0，在17个灵长类物种中的保守性指数为76.5%，而且位于tRNAGln高度保守的位置上，表明线粒体tRNAGln4363T＞C突变可能是这3个母系遗传EH家系发病的主要分子基础。与其他与高血压相关的mtDNA突变一样，tRNAGln4363T＞C也是同质性突变，该突变位于tRNAGln二级结构反密码子环的A38位置，可能影响线粒体tRNA的结构和功能，

导致轻度的线粒体功能缺陷，进而引发疾病的产生。WHP13家系母系成员EH发病率远高于另外2个家系，且临床特征较另外2个家系有所不同，推测线粒体ND1 3394T＞C突变可能与tRNAGln4363T＞C突变共同作用影响该家系EH表型的表达。而3个携带线粒体tRNAGln4363T＞C突变的EH家系表现出的同质性突变、发病年龄及外显率不同等表型差异特征提示核修饰基因、环境因素和线粒体遗传背景等可能对tRNAGln4363T＞C突变家系EH的表型表达有一定的影响[29] 。

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（本文编辑：吴健敏）

The genetic analysis of mitochondrial tRNAGln4363 T ＞ C mutation associated with essential hypertension in three Chinese Han pedigrees

YU Han1,GENG Junwei1,LIN Zhi1,XUE Ling1,TANG Xiaowen1,ZHENG Binjiao1,LV Jianxin1,LU Zhongqiu1,GUAN Minxin1,3.
1.Attardi Institute of Mitochondrial Biomedicine,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325035; 2.Department of Emergency,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 3.Institute of Genetics,Zhejiang University,Hangzhou,310058

Objective:To analyze and evaluate the clinical,genetic and molecular characteristics of mtDNA in three Han Chinese pedigrees with essential hypertension and explore the role of tRNAGln4363T＞C mutation in the development of those maternally inherited essential hypertension.Method:Mitochondrial tRNA gene of 848 Chinese Han essential hypertension subjects and 254 control subjects were amplified with PCR.Members of 3 Chinese Han pedigrees with mitochondrial tRNAGln4363T＞C mutation underwent mitochondrial DNA genetic analysis and pedigree assessment.Result:Three essential hypertension subjects were found with tRNAGln4363T＞C mutation,and with variable severity and age-of-onset in hypertension among the three pedigrees.The percentage of this mutation was 0.35%.Twelve of 28 matrilineal relatives in these families exhibited the variable degree of hypertension at the age at onset of 27 to 64 years old and at the average of 44 years old,while none of the offspring at affected father had hypertension.Sequence analysis of complete mitochondrial genomes in 3 pedigrees showed that,in addition to the homoplasmic 4363T＞C mutation,there were also 64 other mutations,and the mtDNA polymorphisms belonged to haplogroups Z3,Z3 and B4d,respectively.The tRNAGln4363T was localized at immediately 3’end to the anticodon,corresponding to highly conserved adenine at position 38 of tRNAGln,the4363C＞T mutation might affect the high fidelity of recognition and the formation and stability of normal tRNA structure.Conclusion:The occurrence of the tRNAGln4363T＞C mutation in three genetically unrelated pedigrees affected by hypertension and the absence in 254 Chinese controls strongly indicate that this mutation is associated with essential hypertension.The homoplasmic form,late onset and incomplete penetrance of hypertension observed in those Chinese pedigrees suggest that tRNAGln4363T＞C mutation may be insufficient to produce a clinical phenotype,nuclear modifier gene (s) or environmental factor (s) may play a role in the phenotypic expression of essential hypertension related to tRNAGln4363T＞C mutation.

essential hypertension; mitochondrial DNA; tRNAGln; gene mutations; Han pedigress

R544.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.05.001

2014-11-26

国家青年科学基金资助项目（31401070，31100903）；浙江省自然科学基金资助项目（Y2110399）；浙江省卫生厅医药卫生科学研究基金资助项目（Y2009A135）；温州医学院科研发展基金资助项目（QTJ13017）。

于涵（1992-），女，黑龙江绥化人，硕士生。

管敏鑫，教授，博士生导师，Email：gminxin88@zju.edu.cn。