eNOS基因rs1799983位点多态性与脑梗死的相关性分析

茅新蕾，韩丽雅，黄向东，管朝红

（温州市中心医院 神经内科，浙江 温州 325000）

·论 著·

eNOS基因rs1799983位点多态性与脑梗死的相关性分析

茅新蕾，韩丽雅，黄向东，管朝红

（温州市中心医院 神经内科，浙江 温州 325000）

目的：研究eNOS基因rs1799983位点多态性与脑梗死的关系。方法：收集2014年5月至9月在我院神经内科住院治疗的脑梗死患者并进行TOAST分型，其中大动脉粥样硬化型（LAA）脑梗死患者83例，小动脉闭塞型（SAO）脑梗死患者100例，收集同期体检中心体检者91例。应用Taqman探针法检测eNOS基因rs1799983位点多态性，比较脑梗死患者临床特征及eNOS基因rs1799983位点多态性。结果：与对照组相比，LAA和SAO脑梗死患者高血压患病率、吸烟及饮酒比例显著增高，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平显著降低（P＜0.01）。3组rs1799983位点均以GG基因型为主，仅LAA组出现1例TT基因型，3组基因型及等位基因的分布差异无统计学意义。结论：LAA和SAO脑梗死有相似的危险因素，温州地区人群eNOS基因rs1799983位点多态性可能与脑梗死发生无关。

脑梗死；单核苷酸，多态性；一氧化氮合酶，内皮型

一氧化氮（NO）参与多种疾病的病理生理过程，其生成主要受NO合酶（NOS）调节。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）是NOS的一种亚型，通过降低NO的合成加速动脉粥样硬化形成，导致缺血性卒中的发生。本研究对eNOS基因rs1799983（G894T）位点多态性与缺血性脑血管疾病的关系进行探讨。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集2014年5月至9月在我院神经内科住院治疗的脑梗死患者并进行TOAST分型，收集大动脉粥样硬化型（large-artery atherosclerosis，LAA）脑梗死患者83例（LAA组）和小动脉闭塞型（small-artery occlusion，SAO）患者100例（SAO组）为病例组，选取同期体检中心体检者91例为对照组，所有入组者均签署知情同意书。排除标准：①血小板计数＞450×109/L或＜100×109/L；②血红蛋白＜9 g/dL；③骨髓增生症病史；④心房颤动病史；⑤恶性肿瘤病史；⑥对照组排除既往脑卒中者。收集所有研究对象的性别、年龄、烟酒史、既往病史等一般资料，并对患者进行TOAST分型。高血压病诊断标准为血压≥140/90 mmHg或正在服用降压药物；糖尿病的诊断标准为空腹血糖≥7.0 mmol/L或正在服用降糖药物；吸烟的标准为≥10支/d；饮酒标准为≥15 g/d。

1.2 方法

1.2.1 血标本检测：利用奥林帕斯5400全自动生化分析仪检测血脂，包括总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。

1.2.2 全血DNA的提取：静脉抽取空腹血1 mL，加20 μL EDTA抗凝，-70 ℃冰箱长期保存。收集完成后一次性抽提DNA，相关试剂由上海生工生物工程公司提供。

1.2.3 eNOS基因rs1799983位点多态性检测：应用Taqman探针法进行检测，实验仪器为LightCycler480 Software Setup（Roche）。引物：rs1799983-FCCCA GGAAACGGTCGC；rs1799983-RTCCCACCCAGTCAATCCCT。探针：rs1799983-FP 5’FAM-GGGATCACTGGGGCCTGCA GCAGCA-3’BHQ1；rs1799983-HP 5’HEX-GGGCTCACTGGG GCCTGCAGCAGC-3’BHQ2。PCR反应体系：2×TaqMan Master Mix 10 μL，20×Primer and TaqMan Probe（FAM VIC）dye mix 1 μL，Template DNA 2 μL，ddH2O 7 μL。完成上述步骤后，把加好样品的384孔板放在LightCycler480 Software Setup（Roche）荧光定量PCR仪进行反应。PCR反应程序：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，共40个循环。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料用表示，组间比较用t检验和方差分析；组间计数资料比较用x2检验；采用Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验样本的群体代表性，基因型和等位基因频率比较采用x2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组研究对象一般情况比较 3组研究对象高血压病患病率、吸烟、饮酒、HDL-C水平，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 3组研究对象一般情况比较（）

表1 3组研究对象一般情况比较（）

3组间比：aP＜0.01

临床特征LAA组（n=83）SAO组（n=100）对照组（n=91）F/x2P年龄（岁）67.11±12.0466.83±11.2165.66±10.35 0.4200.656a男[ n（%）]50（60.24）66（66.00）45（49.45） 5.4930.064a高血压[ n（%）]71（85.54）83（83.00）45（49.45）36.9650.000a2型糖尿病[ n（%）]27（32.53）33（33.00）22（24.18） 2.1540.341a吸烟[ n（%）]22（26.51）21（21.00） 4 （4.40）16.5730.000a饮酒[ n（%）]19（22.89）21（21.00） 4 （4.40）13.8690.001aTC（mmoL/L）4.91±1.354.73±1.314.87±1.02 0.5500.579aTG（mmoL/L）1.49±0.591.74±0.921.62±1.07 1.8800.155aHDL-C（mmoL/L）1.19±0.281.19±0.261.32±0.39 5.5400.004aLDL-C（mmoL/L）2.97±1.042.76±0.922.81±0.75 1.2800.279a

2.2 eNOS基因rs1799983位点多态性 rs1799983：CCTGCTGCTGCAGGCCCCAGATGA[G/T]CCCCCAGAACTCTT CCTTCTGCCCC。T型即A型探针，为FAM标记；蓝色荧光，表现为X型；G型即C型探针，为HEX标记；绿色荧光，表现为Y型；G/T杂合型，为红色荧光，表现为XY型，见图1。

2.3 3组研究对象Hardy-weinberg平衡检验 3组研究对象eNOS基因rs1799983位点基因型频率分布符合Hardy-weinberg平衡，样本具有群体代表性，见表2。

图1 eNOS基因rs1799983位点基因型

2.4 3组研究对象eNOS基因rs1799983位点基因型比较 3组中仅LAA组出现1例TT基因型，均以GG基因型为主。3组基因型的分布无差异（x2=2.5113，P＞0.05）。3组中T、G等位基因分布亦无差异（x2= 0.1042，P＞0.05），见表3。

2.5 病例组和对照组eNOS基因rs1799983位点多态性比较 2组中eNOS基因rs1799983位点基因型的分布差异无统计学意义（x2=0.6867，P＞0.05）。2组中T、 G等位基因分布差异无统计学意义（x2=0.0490，P＞0.05），见表4。

表2 3组研究对象eNOS基因rs1799983位点基因型Hardy-Weinberg平衡性检验

表3 3组研究对象rs1799983位点基因型比较[ n（%）]

表4 病例组和对照组rs1799983位点等位基因型比较[ n（%）]

3 讨论

脑梗死是由多种环境和遗传因素共同作用所导致的疾病。众所周知，高血压、糖尿病、血脂异常、吸烟、酒精、心脏疾病等是脑梗死的危险因素。但这些危险因素对各种卒中亚型影响如何并不明确。我们将LAA、SAO组脑梗死患者相关临床特征与体检者比较发现，高血压病患病率、吸烟、饮酒、HDL-C水平差异有统计学意义。但进一步两两比较未见上述危险因素在LAA和SAO亚型中的差异。提示大、小各种管径的动脉病变存在部分相同危险因素[1]。由于本次收集的体检者基本为老年人，亦存在血管病危险因素，故糖尿病、LDL-C等未见显著性差别。此结果提示尽量减少患者可控性血管病危险因素的意义很大。

除环境因素外，脑梗死与遗传因素关系密切。目前，对缺血性脑血管疾病基因的研究多采用候选基因法，与其相关的候选基因包括NOS基因、血小板相关基因、脂代谢基因、凝血/纤溶基因、同型半胱氨酸代谢基因等。候选基因成为研究脑梗死遗传机制的重点。近年来研究[2]发现，TOAST分型中不同亚型的脑梗死有不同的遗传易感基因。

NO是脑血管系统中的重要保护因子之一，在NOS催化下生成，不同类型NOS催化生成的NO作用并不相同。目前发现3种NOS亚型，eNOS主要存在于血管内皮细胞、神经组织和血小板中，与脑血管疾病的发生关系密切，eNOS催化产生的NO具有神经保护作用。eNOS由NOS3基因编码，人类eNOS基因定位于染色体的7q36，全长约21 kb，包含26个外显子和25个内含子。eNOS基因多态性可影响人体内NO的浓度[3]。目前已发现多种eNOS 基因的多态性位点，如G894T、A922G、4a/4b等。G894T是其中研究较多的位点之一，位于eNOS基因的第7外显子894位碱基由G到T的突变，可以导致密码子第298位的谷氨酸转变为天门冬氨酸，因改变eNOS的活性而导致NO的活性降低。有研究[4]发现，eNOS G894T与缺血性脑卒中显著相关，但该位点基因多态性与不同亚型脑梗死间的关系目前尚不明确。

本研究结果显示LAA组、SAO组及对照组eNOS基因rs1799983（G894T）位点基因型均以GG基因型为主，3组基因型的分布无差异，3组中T、G等位基因分布亦无差异，未发现G894T等位基因与缺血性脑血管疾病的相关性。这与Grewal等[5]、Guldiken等[6]研究结果一致，但亦有研究[7]得出相反结论。

参考文献：

[1] 吕洋辉, 何松彬, 唐维国, 等. 头颈部大动脉粥样硬化与脑白质疏松相关性分析[J]. 温州医科大学学报, 2014, 44(12): 872-876.

[2] Bevan S, Traylor M, Adib-Samii P, et al. Genetic heritability of ischemic stroke and the contribution of previously reported candidate gene and genomewide associations[J]. Stroke, 2012, 43(12): 3161-3167.

[3] Ikenouchi-Sugita A, Yoshimura R, Kishi T, et al. Three polymorphisms of the eNOS gene and plasma levels of metabolites of nitric oxide in depressed Japanese patients: a preliminary report[J]. Hum Psychopharmacol, 2011, 26(7): 531-534.

[4] Niu PP, Yang G, Zheng BK, et al. Relationship between endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms and ischemicstroke: a meta-analysis[J]. Acta Neurol Scand, 2013, 128(3): 202-212.

[5] Grewal RP, Dutra AV, Liao YC, et al. The intron 4c allele of the NOS3 gene is associated with ischemic stroke in African American[J]. BMC Med Genet, 2007, 10(8): 76.

[6] Guldiken B, Sipahi T, Guldiken S, et al. Glu298Asp polymorphism of the endothelial nitric oxide synthase gene in Turkish patients with ischemic stroke[J]. Mol Biol Rep, 2009, 36(6): 1539-1543.

[7] 章志量, 魏丹宏, 沈荣林, 等. 内皮型一氧化氮合酶基因G894T突变与脑梗死的相关研究[J]. 健康研究, 2009, 29(3): 180-183.

（本文编辑：吴彬）

The correlative analysis of eNOS rs1799983 single-nucleotide polymorphisms and cerebral infarction

MAO Xinlei, HAN Liya, HUANG Xiangdong, GUAN Chaohong. Department of Neurology, Wenzhou Central Hospital, Wenzhou, 325000

Objective: To investigate the relationship of eNOS rs1799983 single-nucleotide polymorphisms (SNP) and cerebral infarction. Methods: Data was prospectively collected from consecutive ischemic stroke inpatients in neurology department of our hospital from may 2014 to september 2014. Eighty-three large-artery atherosclerosis (LAA) patients and small-artery occlusion (SAO) patients in 100 patients were enrolled, according to the TOAST criteria. The control group was 91 subjects from the Medical Examination Center at the same period. Taqman probe technique was used for the detection of eNOS rs1799983 SNP. The clinical characteristics and eNOS rs1799983 SNP were compared between three groups. Results: As compared with the controls, there were statistically signifcant differences in percentage of HBP, smoking, drinking, high-density lipoprotein and cholesterol concentrations in LAA and SAO groups (P＜0.01). The GG genotype was main genotype in three groups. Only 1 case TT genotype was observed in LAA group. The frequency of allele and genotype was not signifcantly difference in these three groups. Conclusion: It is suggested that there are similar risk factors in LAA and SAO patients. The eNOS rs1799983 SNP maybe unrelated to cerebral infarction.

cerebral infarction; polymorphism, single nucleotide; endothelial nitric oxide synthase

R743.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.09.006

2014-11-27

浙江省医药卫生科技计划项目（2011KYA148）。

茅新蕾（1975-），男，江苏南通人，副主任医师，硕士。通信作者：韩丽雅，主任医师，Email：wzeyhly@163.com。