猪小肠黏膜下层与嗅鞘细胞生物相容性实验

李玉安，李佳，徐华梓，林大木，吴志鹏

（温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 骨科，浙江 温州 325027；2.温州医科大学附属第一医院神经内科，浙江 温州 325015）

·论 著·

猪小肠黏膜下层与嗅鞘细胞生物相容性实验

李玉安1，李佳2，徐华梓1，林大木1，吴志鹏1

（温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 骨科，浙江 温州 325027；2.温州医科大学附属第一医院神经内科，浙江 温州 325015）

目的：探讨以小肠黏膜下层（SIS）作为生物支架对嗅鞘细胞（OECs）增殖的生物相容性。方法：用Abraham法制取猪小肠黏膜下层，将小肠黏膜下层与纯化的嗅鞘细胞复合培养作为实验组，单纯嗅鞘细胞培养作为对照组；定期进行倒置显微镜、HE染色、扫描电镜观察细胞与材料的黏附生长情况，及CCK8增殖实验定量检测细胞增殖情况。结果：实验组小肠黏膜下层与嗅鞘细胞复合培养后，倒置显微镜下可见嗅鞘细胞在24 h内即可贴壁生长；3～5 d后可见小肠黏膜下层边缘嗅鞘细胞密集，黏附良好，形态以梭形细胞、三极细胞为主；不同时间点HE染色、电镜下可见嗅鞘细胞与猪小肠黏膜下层附着紧密，细胞生长良好。CCK8细胞增殖定量检测发现，实验组细胞7～9 d后达平稳水平，11 d后略下降；前5 d实验组细胞增殖能力低于对照组，差异有统计学意义（均P＜0.05），培养至第7天2组细胞增殖能力差异无统计学意义（均P＞0.05）。结论：未发现小肠黏膜下层对嗅鞘细胞增殖有抑制作用，两者间生物相容性良好，有望用作生物支架供嗅鞘细胞黏附生长。

嗅鞘细胞；小肠黏膜下层；支架；脊髓损伤

组织工程利用嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）移植治疗脊髓损伤成为近年来脊柱外科领域的研究热点[1-5]，但由于缺乏理想的细胞移植支架材料，在体外及体内实验中单纯移植OECs却未得到预期的效果；因此选择合适的支架材料用以OECs移植以增强脊髓损伤修复效果是今后研究方向之一。小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）作为支架材料在修复组织缺损的实验研究和临床应用中取得满意效果[6-8]，有一定临床应用前景[9]。本实验将体外分离培养的OECs与SIS复合培养并探讨以小肠黏膜下层作为OECs移植支架材料的可能性。

1 材料和方法

1.1 SIS生物支架材料制备 参照Abraham法[10]取成年猪的新鲜近段空肠，冲洗后刮除黏膜层、浆膜层和肌层；进一步应用化学方法：①在含有乙二胺四乙酸（100 mmol/L）和氢氧化钠（10 mmol/L）溶液（pH值11～12）中浸泡16 h；②用去离子水冲洗干净，置于含盐酸（1 mmol/L）和氯化钠（1 mmol/ L）溶液（pH值0～1）中浸泡6～8 h；③用去离子水冲洗后在1 mmol/L氯化钠磷酸缓冲液（PBS）中浸泡16 h；④用去离子水冲洗后在PBS溶液（pH值7～7.4）中浸泡2 h；⑤再用去离子水冲洗基质2 h；⑥杀菌：将SIS在含0.1%过氧乙酸的20%乙醇溶液中浸泡8 h，用含0.05%叠氮化钠的PBS溶液清洗2 h，然后程序性降温至-80 ℃，冻干后用γ射线照射（25～35 kGy）消毒，进行脱细胞和灭菌处理。

1.2 OECs的体外培养及鉴定 选取8～10周龄的成年SD大鼠，无菌条件下切取嗅球、剪碎，用含0.02% EDTA-0.25%胰蛋白酶消化15～20 min，再用含10%胎牛血清培养液终止消化。机械轻柔吹打20～30次，于水平离心机中以300 g离心5 min，去除上清液留沉淀物，加入含10%胎牛血清的DME/F12培养液，重悬成细胞悬液，调整细胞浓度为5×105/mL，然后采用18 h单次差速贴壁的方法纯化培养嗅鞘细胞处理后OECs纯度达70%～80%，10～12 d细胞长满瓶底，消化后将细胞接种于玻片，使用神经生长因子受体P75（NGFRP75）和碘化丙啶（PI）双重免疫荧光鉴定嗅鞘细胞[11-12]。

1.3 分组方法 实验组为OECs与SIS的复合培养，将SIS剪成96孔板洞孔大小，平铺于96孔板中，Hanks液浸泡24 h；取生长状态良好的OECs细胞悬液100 μL，浓度为1×105/mL滴加于SIS表面，加培养液置于37 ℃、体积分数5% CO2恒温培养箱中培养。对照组为单纯嗅鞘细胞培养，直接将OECs悬液加于无SIS材料孔中进行培养，每组各有7对，每对各设6孔。

1.4 细胞观察方法 ①每天于相差显微镜下观察培养基有无混浊、细胞生长及与SIS材料附着的情况；②分别于OECs与SIS复合培养1、3、5、7、9、11、13 d后取出SIS，用D-Hanks液洗涤干净后进行HE染色观察；③OECs与SIS复合培养1、3、5、7、9、11、13 d后取出SIS，2%戊二醛固定2 h，再用1%锇酸后固定2 h。乙醇梯度脱水，HITACHI E-1010型离子溅射仪中喷金，于HITACHI S-3000N扫描电镜下观察。

1.5 CCK8细胞增殖定量检测 分别于OECs与SIS复合培养1、3、5、7、9、11、13 d后对2组进行CCK8细胞增殖定量检测。实验操作方法按照试剂盒（上海碧云天科技有限公司）的程序进行，用酶标仪于450 nm，参比波长600 nm下测定OD值。每个时间段各取6个孔样本，检测结果取平均值。

1.6 统计学处理方法 采用SPSS12.0统计软件对数据进行分析。计量资料以表示，2组间比较用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 倒置显微镜观察结果 实验组18～24 h后可见大量双极和三极细胞贴壁生长，也有少量多角扁平细胞生长；3～5 d后细胞突起进一步延长并开始连接成网状结构。在SIS周边区域细胞比较密集，黏附良好，多呈长梭形生长。7～9 d网孔更密集，出现部分区域1～2层细胞重叠生长。11～13 d细胞数量达至最大，出现接触抑制现象。免疫荧光细胞化学反应鉴定其抗P75抗体呈阳性，见图1。

2.2 HE染色观察结果 实验组1 d后行HE染色尚很难在SIS材料上发现细胞。将OECs与SIS复合培养3～5 d后，几乎可以在SIS的任意区域发现OECs细胞，呈单层生长，与SIS黏附紧密。7～13 d时细胞进一步增多，部分区域细胞呈2～3层重叠生长，见图2。

2.3 扫面电镜观察结果 OECs细胞在SIS表面生长旺盛，黏附良好，呈长梭、纺锤或长三角形，胞体立体感强，突起细长，连接成网或成束排列，部分细胞表面可见蛋白颗粒分泌。5～7 d后呈密集生长，突起联系增多，网孔减小，连接成片，见图3。

图1 OECs与SIS复合培养3～5 d后OECs增殖明显，细胞突起进一步延长并开始连接成网状结构（×200）

图2 OECs与SIS复合培养7～13 d，OECs进一步增殖，部分区域细胞呈2～3层重叠生长（×400）

图3 OECs细胞与SIS复合培养7 d呈密集生长，突起联系增多，网孔减小，连接成片，细胞表面可见蛋白分泌颗粒（×400）

2.4 CCK8细胞增殖定量检测结果 OECs与SIS复合培养后增殖良好，细胞总量随着时间延长逐渐增高，第7天后细胞数量即达较高水平，11 d时达顶峰，随后开始下降。OD值第1天（1.38±0.10）逐渐增加至第11天（2.65±0.20）。OECs组增殖趋势与复合培养基本一致。第1、第3、第5天对照组OD值比实验组高，差异有统计学意义（均P＜0.05）；第7、第9、第11、第13天2组间差异无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 CCK8细胞增殖定量检测结果（OD值，n=6，）

表1 CCK8细胞增殖定量检测结果（OD值，n=6，）

天数实验组对照组tP 11.38±0.101.72±0.047.783＜0.001 31.87±0.092.51±0.265.740＜0.001 52.40±0.102.63±0.143.2910.008 72.49±0.322.60±0.120.7790.454 92.61±0.322.71±0.150.7380.478 112.65±0.202.68±0.240.1850.857 132.48±0.562.38±0.460.3270.750

3 讨论

随着对OECs研究的逐渐深入以及OECs移植治疗脊髓损伤动物实验的广泛开展，近年来国内外已经陆续开展了利用OECs移植治疗脊髓损伤的人体临床试验，但是令人感到遗憾的是这些临床试验在疗效上未达到预期[14-16]。因此我们需要在OECs移植同时求助于其他的他辅助手段。研究[17-18]表明，脊髓损伤后局部常形成胶质瘢痕与较大的空洞，单独OECs移植后细胞在瘢痕空洞中缺乏细胞外基质的支持作用，细胞在空洞中缺乏可以黏附生长的支架，细胞因子与细胞外基质的分泌亦难以在局部聚集以形成有利于细胞生存的微环境。因此合适的支架材料也是修复脊髓损伤的关键。

SIS是一种不含细胞的天然细胞外基质生物材料，主要由I型胶原和 III型胶原纤维组成，含有少量的V型和VI型胶原纤维，组成上接近于天然结缔组织的成分，是一种理想的支架材料。很多的体外实验[7-8，19-21]都证实了SIS：①有良好的组织相容性；②可降解性和降解速率可控性；③无抗原作用；④维持细胞形态和表型，并增进细胞的黏附和生殖，诱导组织再生；⑤有一定孔隙率；⑥有一定机械强度。另外SIS已经在修复下尿路、膀胱、血管、肌腱、韧带、骨、半月板等多种组织缺损的实验和临床应用研究中取得了良好的效果。

本实验在体外将SD大鼠嗅球OECs与猪SIS进行复合培养，通过倒置显微镜和扫描电镜观察，可以发现OECs在SIS表面生长旺盛，增殖迅速，两者之间黏附紧密。同正常培养的OECs相比，与SIS复合培养的OECs虽在早期生长稍弱，但在后期增殖迅速，数量上差异无统计学意义；通过CCK8细胞增殖定量检测发现OECs和SIS复合培养与正常培养的OECs相比在细胞增殖方面，1～5 d时两者增殖程度差异有统计学意义，其中OECs与SIS复合组稍弱，但7 d后两者的细胞增殖程度的差异就已经无统计学意义了。7 d对于嗅鞘细胞来讲尚处于对数生长期，而临床上获取细胞通常在这个阶段或之后，因此在获取细胞时两者差异无统计学意义，因此本实验虽未发现SIS对OECs有促增殖作用，但在SIS材料上复合培养的OECs在形态上与正常培养的OECs相同，生长旺盛，且在培养中后期（5～7 d后）与正常培养的OECs数量上差异无统计学意义，较为客观地说明了SIS与OECs具有良好相容性。SIS作为支架材料，在进行细胞移植获取细胞的时候，生长于SIS上的OECs可以同SIS一起取下，避免了酶的消化对细胞的损伤。更为重要的一点是，SIS作为OECs的生长支架，随着OECs一起进行移植进入体内时，等同于给OECs营造了一个熟悉的生长环境，更有利于移植的OECs存活，使其发挥强大的修复脊髓损伤的功能。另外SIS对脊髓空洞的填充作用，避免了细胞的悬浮及流失，进一步促进了OECs功能的发挥。

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（本文编辑：吴彬）

Biocompatibility experiment of small intestinal submucosa with olfactory ensheathing cells

LI Yu’an1, LI Jia2, XU Huazi1, LIN Damu1, WU Zhipeng1. 1.Department of Orthopaedics, the Second Affiliated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To explore the biocompatibility of small intestinal submucosa as a biological scaffold on the proliferation of olfactory ensheathing cells. Methods: The porcine small intestinal submucosa (SIS) was made according to Abraham’s methods. seeding the OECs on the porcine SIS for experimental group (SIS+OECs), OECs cultivating alone as control group. Then OECs’ growth, adhesion and proliferation of OECs on SIS was examined by HE stained and scanning electron microscope at different time during the cultivation, and the proliferation of OECs was examined with CCK8 as well. Results: OECs could attach to SIS within 24 hours after seeded on the SIS. After being cultured 3 to 5 days, OECs were intensive on the edge of SIS, well adhered to it and the cells were most fusiform and tripolar in shape. The combination of SIS and OECs was very excellently examinated by scanning electron microscope and Haematoxylin and eosin stained. And CCK8 measurement also revealed that, the quantity of OECs reached a stable level at 7 to 9 day and this level would not decreased until 11 d. Compared with these in contrast group, the proliferation of OECs on SIS had obvious difference during the former 5 days (P＜0.05) but there was no signifcant difference after 7 day (P＞0.05). Conclusion: Porcine SIS has good biocompatibility with rat OECs, although there is no evidence showing SIS promoting OECs’ proliferation. SIS can expectedly be used in repair of spinal cord injury as a scaffold where OECs may grow and adhere.

olfactory ensheathing cells; small submucosa intestinal; scaffold; spinal cord injury

R318.19

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.09.007

2014-07-31

温州市科技局对外合作项目（H20080031）。

李玉安（1983-），男，浙江温州人，硕士。

徐华梓，教授，主任医师，博士生导师，Email：spine xu@163.com。