姜黄素衍生物L6H4对糖脂代谢异常大鼠的治疗作用及其机制

陈四梅，张森凯，刘网网，徐梦菲，陈三妹，陈国荣，陈筱菲

（1.温州医科大学附属第一医院 医学检验中心，浙江 温州 325015；2.乐清市人民医院，浙江 温州325605；3.温州医科大学附属第一医院 病理科，浙江 温州 325015；4.绍兴文理学院 医学院，浙江绍兴 312000）

·论 著·

姜黄素衍生物L6H4对糖脂代谢异常大鼠的治疗作用及其机制

陈四梅1，张森凯2，刘网网3，徐梦菲3，陈三妹4，陈国荣3，陈筱菲1

（1.温州医科大学附属第一医院 医学检验中心，浙江 温州 325015；2.乐清市人民医院，浙江 温州325605；3.温州医科大学附属第一医院 病理科，浙江 温州 325015；4.绍兴文理学院 医学院，浙江绍兴 312000）

目的：观察姜黄素衍生物L6H4对糖脂代谢异常大鼠代谢指标的影响，并对其作用机制进行初步探讨。方法：24只8周龄雄性SD大鼠随机分为正常空白对照组（NC组，n=8），高脂组（HF组，n=8）和高脂治疗组（FT组，n=8），后2组高糖高脂饲料喂养12周。第5周时开始给予药物治疗8周，12周末检测各组大鼠血清生化指标、肝脏和骨骼肌的甘油三酯（TG），以及与糖脂代谢相关的多项指标，并观察光镜下肝脏与骨骼肌的病理学变化。结果：①HF组与NC组比较，体质量增加（P＜0.05），肝湿质量、空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）、胰岛素抵抗指数（HOME-IR）、血清TG、肝脏TG、骨骼肌TG、血清ALT、血清游离脂肪酸（FFA）、高敏C反应蛋白（hs-CRP）和白介素6（IL-6）水平均升高（均P＜0.01），脂联素（ADP）、瘦素（LEP）下降（分别P＜0.01，P＜0.05），成纤维细胞生长因子21（FGF-21）差异无统计学意义（P＞0.05）；②FT组与HF组比较，FINS、肝湿质量与肝指数差异均无统计学意义（P＞0.05），体质量、肝脏TG、血TG、ALT、FBG、HOMEIR、FFA、hs-CRP水平降低（P＜0.01），骨骼肌TG、IL-6水平下降（P＜0.05），FGF-21、ADP升高（P＜0.01）；③HF组肝脏可见明显脂肪变及炎症细胞浸润，骨骼肌细胞间质可见脂肪浸润，治疗后肝脏脂肪变以及骨骼肌脂肪浸润明显改善。结论：姜黄素衍生物L6H4对高脂高糖喂养大鼠具有控制体质量、保护肝功能、改善胰岛素抵抗的作用，可能与其调脂、抑制炎症、降低异位脂肪存积相关。

姜黄素衍生物L6H4；胰岛素抵抗；异位脂肪沉积；高脂血症；大鼠

肥胖已成为全球公共健康问题，是脂质代谢紊乱、非酒精性脂肪肝、心血管疾病、2型糖尿病等疾病的高危因素。2012年我国成年人血脂的调查报告[1]显示，31.5%的成年人有高总胆固醇血症。研究[2]表明，单纯性肥胖儿童多存在血脂代谢紊乱情况。因此伴随肥胖而来的相关代谢性疾病将使社会及医疗体系面临严峻的考验。近些年较多学者致力于肥胖及其相关代谢性疾病关系研究，不断摸索开发新的降脂降糖药物，并探讨药物的治疗机制。其中，姜黄素及相关衍生物的抑制炎症、调脂降糖的作用已被公认[3]，但天然的姜黄素结构不稳定，在生物体内的利用度低。为克服这一弱点，研究者们开始研究通过改变姜黄素的结构改善其生物利用度。本研究所用姜黄素衍生物L6H4系温州医科大学药学院在姜黄素的基础上合成的新型不对称单羰基姜黄素衍生物，前期实验[4]已证明较姜黄素具有更好的稳定性，同时细胞水平研究表明该新型姜黄素衍生物具有良好的炎症抑制活性。我们利用高脂高糖饲料饲养SD大鼠，探讨姜黄素衍生物L6H4对高脂高糖大鼠相关代谢指标的影响，并初步探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物喂养方法及处理 SD大鼠购自温州医科大学实验动物中心，24只，雄性，SPF级，体质量150～180 g。随机分为3组，每组8只：正常空白对照组（NC组）、高脂对照组（HF组）和高脂治疗组（FT组）。适应性喂养1周后，NC组始终常规饲料喂养，HF组和FT组给予高脂高糖饲料（饲料组成[5]：10.0%猪油，20.0%蔗糖，2.5%胆固醇，1.0%胆酸盐，66.5%常规饲料）饲养12周，第5周开始进行为期8周的药物治疗，给药剂量每天20 mg/kg。药物为白色粉末，不溶于水，操作时溶于1%的羧甲基纤维素钠溶液配制成混悬液灌胃给予，NC组给予等剂量安慰剂（1%的羟甲基纤维素钠溶液）治疗。受试药物姜黄素衍生物L6H4由温州医科大学药学院梁广教授惠赠。

1.2 主要试剂 ELISA试剂盒购于上海联硕生物科技有限公司，胰岛素放射免疫试剂盒购于上海瑞齐生物科技有限公司。

1.3 血清标本采集及指标测定 治疗满8周后，大鼠空腹12 h，10%水合氯醛以0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，准确称取大鼠质量，切断股动脉采血8～10 mL于促凝离心管中，室温静置低温离心取得血清分装在数个1.5 mL EP管中，藏于-40 ℃冰箱备用。全自动生化分析仪检测相关生化指标，酶联免疫吸附法（ELISA法）测血清高敏C反应蛋白（hs-CRP）、游离脂肪酸（FFA）、鼠成纤维细胞生长因子21（FGF-21）、白细胞介素6（IL-6）、瘦素（LEP）、脂联素（ADP），放射免疫法检测血清空腹胰岛素水平（FINS），实验步骤严格按说明书进行操作。

1.4 肝脏、肌肉组织甘油三酯（TG）的测定 准确称取100 mg大鼠骨骼肌组织与肝脏组织，加入甲醇/氯仿混合液（甲醇∶氯仿，体积比=2∶1），超声波破碎，4 ℃静置抽提30 min，6 000 r/min低温离心10 min，取有机脂质抽提相溶于异丙醇中，由全自动生化分析仪测定结果并进行统计分析，详细操作完全参照Folch法[6]。

1.5 病理学检测 观察各组大鼠肝脏的大小形态、颜色、质地，并将取出的肝脏、骨骼肌组织块（约10 mm×10 mm×2 mm）用中性甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，中性树胶封固。光镜下观察组织的脂肪变、炎症等情况。

1.6 胰岛素抵抗的评价 采用稳态模型计算的胰岛素抵抗指数[7]（homeostasismodel assessment of insulin resistance index，HOMA-IR）评价胰岛素抵抗，计算公式：HOMA-IR=空腹血糖（FBG）（mmol/L）×FINS（mU/L）/22.5。

1.7 统计学处理方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。实验数据以表示，各组数据均符合正态分布。组间两两比较采用单因素方差分析LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 实验结束时，与NC组比较，HF组大鼠体质量、肝湿质量、肝指数（肝湿质量/体质量）均升高（P＜0.01）；与HF组比较，FT组大鼠体质量下降（P＜0.01），肝湿质量与肝指数差异无统计学意义，见表1。图1示各组大鼠实验过程中体质量的变化趋势。

表1 各组大鼠一般指标比较（n=8，±s）

图1 各组大鼠体质量变化趋势图

2.2 病理变化

2.2.1 肉眼观察：NC组大鼠肝脏外观形态正常，呈红褐色，表面光滑有光泽，边缘锐利，质韧；HF组大鼠肝脏体积明显增大，表面粗糙，包膜紧张，边缘变钝，颜色为红黄相间，质软，局部肝叶呈明显脂肪变性。FT组肝体积近似正常组，呈现砖红色，表面光滑，边缘锐利。NC组骨骼肌表面光滑，呈肌红色，柔软质韧弹性良好，HF组骨骼肌触之有油腻感，颜色偏暗，弹性尚可，治疗后油腻感减轻。

2.2.2 光镜观察：HE染色NC组肝脏肝细胞排列正常，无脂滴和炎症细胞浸润，骨骼肌纤维呈细长条带状，互相平行排列，细胞核紧贴肌膜分布，肌纤维中横纹清晰可见。HF组肝细胞出现弥漫性脂肪变性，以中央静脉周围最为明显，细胞体积增大，胞浆中有大量脂滴空泡，核居边，且小叶内有炎症细胞浸润。骨骼肌细胞内见少许脂肪空泡，间质脂肪空泡明显。FT组肝脂肪变明显改善，骨骼肌细胞未见脂肪空泡，与NC组无肉眼可见异常。见图2。

2.3 血清指标 HF组与NC组比较，FBG、FINS显著升高（P＜0.01），HOME-IR明显升高；FT组与HF组比较，FBG显著降低（P＜0.01），FINS差异无统计学意义（P＞0.05），HOME-IR降低，差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。

图2 各组大鼠肝脏与骨骼肌石蜡切片（HE，×400）

表2 各组大鼠间FBG、FINS、HOME-IR的比较（n=8，±s）

2.4 血清、肝脏与肌肉组织TG含量 HF组与NC组相比较，血清、肝组织与肌组织的TG含量显著增高（P＜0.01），ALT显著升高（P＜0.01）；与HF比较，FT组各组织TG含量得到显著改善，差异有统计学意义（P＜0.05），ALT显著下降（P＜0.01）。见表3。

2.5 相关炎症因子 HF组与NC组比较，FFA、hs-CRP、IL-6显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01），ADP、LEP显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。FGF-21在HF组有下降的趋势，差异不明显，在FT组明显升高，与HF组比较差异有统计学意义（P＜0.01），见表4-5。

表3 各组大鼠血TG、肝TG与骨骼肌TG的结果比较（n=8，）

表3 各组大鼠血TG、肝TG与骨骼肌TG的结果比较（n=8，）

与NC组比：aP＜0.01；与HF组比：bP＜0.05，cP＜0.01

表4 各组大鼠FFA、hs-CRP、FGF-21结果比较（n=8，）

表4 各组大鼠FFA、hs-CRP、FGF-21结果比较（n=8，）

与NC组比：aP＜0.01；与HF组比：bP＜0.01

表5 各组大鼠ADP、LEP、IL-6的比较（n=8，）

表5 各组大鼠ADP、LEP、IL-6的比较（n=8，）

与NC组比：aP＜0.01；与HF组比：bP＜0.05，cP＜0.01

3 讨论

近年来关于肥胖患者糖脂代谢紊乱的研究颇多，普遍认为胰岛素抵抗、慢性炎症以及异位脂肪存积等是肥胖与相关代谢性疾病关联的主要因素，而脂肪组织分泌的各类细胞因子则是它们相互关联的纽带[8]。正常情况下过多的脂肪，作为能量储存库，存在于脂肪组织。过度肥胖时，脂肪细胞会产生胰岛素抵抗来对抗脂肪组织的扩张，因而限制了脂肪组织进一步的脂肪合成以及脂肪细胞分化，同时促进脂肪细胞分解，使得FFA增加，导致异位脂肪组织摄取FFA增加，出现脂肪异位存积。

从基础实验证据到临床人群观察研究的诸多研究结果表明，冠心病、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝等很大程度上是一种系统性的炎症过程[9]。炎症使机体处于分解代谢状态，它通过胰岛素抵抗机制，抑制原本胰岛素敏感区域的合成代谢，如脂肪组织与骨骼肌，从而优先保证炎症区域的营养供给，其本质是导致胰岛素作用组织产生胰岛素抵抗[9]。本实验通过高糖高脂饲料喂养大鼠共12周，实验结果显示，HF组表现为明显体质量增加、炎症、糖脂代谢紊乱以及脂肪异位沉积等胰岛素抵抗表现，与相关研究[10]结果一致。经过药物治疗的FT组，炎症得到明显控制，血清FFA下降，肝脏和骨骼肌TG明显下降，提示姜黄素衍生物L6H4可作用于脂肪组织，抑制促炎因子同时促进抑制炎症脂肪细胞因子如ADP等分泌来降低高血脂和脂肪异位存积，改善肝功能，降低胰岛素抵抗。

近几年有关FGF-21降糖作用的研究颇多，研究[11]表明FGF-21是一种不依赖胰岛素而是通过诱导葡萄糖转运子1来增加组织对葡萄糖摄取的成纤维细胞生长因子。同时FGF-21提升胰岛素的敏感性，维持葡萄糖脂质稳态，保护β细胞的功能。本实验结果显示，与HF组比较，FT组的血清FGF-21显著上升，而FINS组间差异无统计学意义，FBG却显著下降，提示姜黄素类似物L6H4可能通过提高大鼠体内FGF-21合成表达调节血糖。

综上所述，姜黄素类似物L6H4有效地增加了促脂肪酸氧化的因子，减少了抑脂肪酸氧化的因素，从而改善了异位脂肪存积，减轻炎症反应，降低循环FFA浓度，所有的这些效应共同提高了胰岛素的敏感性，从而使得血糖血脂紊乱得到纠正，避免了胰岛素抵抗进一步发展为更严重的代谢性疾病，具有良好的抑制炎症、降糖、调脂作用，但其具体作用机制还有待进一步的研究。

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（本文编辑：胡苗苗）

The therapeutic effect of curcumin derivatives L6H4 on rats with abnormalities of glucose and lipid me-tabolism and its mechanism

CHEN Simei1, ZHANG Senkai2, LIU Wangwang3, XU Mengfei3, CHEN Sanmei4,CHEN Guorong3, CHEN Xiaofei1.
1.Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Yueqing People’s Hospital, Wenzhou, 325605; 3.Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 4.School of Medical Sciences, Shaoxing University, Shaoxing, 312000

Objective: To observe the effect of curcumin derivatives L6H4 on rats with abnormalities of glucose and lipid metabolism, and preliminarily study the mechanism of it. Methods: Twenty-four male SD rats were randomly allocated into three groups: normal control group (NC group, n=8), high fatty group (HF group, n=8), and fatty treatment group (FT group, n=8). To fed the rats in HF group and FT group with high fat and surgar diet for 12 weeks, from the 5th week with drug treatment for 8 weeks, at the end of 12th week, the following indexes were measured respectively in each group: serum biochemical indexes, liver and skeletal muscle triglycerides, and related indicators of sugar and lipid matabolism. Observing the liver pathological changes at the same time. Results: ①Compared HF group with NC group: weight gain (P＜0.05), liver weight, fasting blood glucose (FBG), fasting insulin (FINS), insulin resistance index (HOME-IR), serum triglycerides, liver triglyceride, skeletal muscle triglycerides, serum ALT, FFA, high-sensitivity c-reactive protein (hs-CRP) and interleukin 6 increased (P＜0.01), adiponectin and leptin decreased (P＜0.01, P＜0.05, respectively). ②Compared the FT group with HF group: weight and ALT loss (P＜0.01), liver weight and liver index had no obvious difference, FBG decreased (P＜0.01), FINS (P＞0.05), the HOME-IR decreased (P＜0.01), serum triglycerides, liver triglycerides andskeletal muscle triglyceride were reduced (P＜0.01, P＜0.01, and P＜0.05, respectively), FFA and hs-CRP reduced (P＜0.01), fibroblast growth factor 21 (FGF-21) increased (P＜0.01), adiponectin, interleukin 6 increased with P＜0.01 and P＜0.05, respectively. ③Infammatory injury in hepatic tissue of HF groups was slight, while fatty degeneration in hepatic tissue and skeletal muscle were obvious, the condition was signifcantly reduced in the FT group. Conclusion: Curcumin derivatives L6H4 has the effect of controlling weight, protecting the liver function and improving the condition of insulin resistance on high fat and sugar-fed rats.

curcumin derivatives L6H4; insulin resistance; ectopic fat deposition; hyperlipidemia; rats

R58

ADOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.03.005

2014-08-31

浙江省公益性技术应用研究计划项目（2011c23123）；温州市高层次人才创新技术项目。

陈四梅（1988-），女，江西永修人，硕士生。

陈筱菲，教授，硕士生导师，Email：wzchenxiaofei@163.com。