诃子及其炮制品对小鼠抗氧化性的研究

诃子及其炮制品对小鼠抗氧化性的研究

谢金炎，何 敏*，梁晓霞，李 雪，廖 礼

(四川农业大学动物医学院，四川雅安 625014)

摘要[目的]对比不同诃子及其炮制品对小鼠抗氧化性的影响。[方法]小鼠灌胃给药不同剂量的原药诃子、茜草制诃子和白狼毒制诃子，然后测定小鼠血清中总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、单胺氧化酶(MAO)、丙二醛(MDA)的含量，同时测定小鼠肝脏中MAO、MDA和脂褐素(LF)的含量，并观察肝脏的组织结构。[结果]诃子及其炮制品可以提高小鼠血清中T-AOC、SOD含量，降低血清及肝脏中MAO、MDA含量，同时也降低肝脏中LF含量，并对肝细胞有一定保护作用。[结论]诃子及其炮制品对小鼠有明显的抗氧化作用。

关键词诃子；炮制品；抗氧化

中图分类号S567

基金项目四川省教育厅科研项目(13SZA0249，10ZB035)；四川省科技厅应用基础计划项目(2014JY0113)。

作者简介谢金炎(1993- )，男，浙江绍兴人，本科生，专业：动植物检疫。*

收稿日期2015-08-18

Study on Antioxidation of Fructus Chebulae and Its Different Processed Products

XIE Jin-yan, HE Min*, LIANG Xiao-xia et al(College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Ya’an, Sichuan 625014)

Abstract[Objective] To compare the influence of the antioxidation of Fructus Chebulae and its different processed products. [Method] The mice were given the different doses of Fructus Chebulae, Fructus Chebulae stir-baking with Rubia Cordifolia, Fructus Chebulae stir-baking with Euphorbia fischeriana Steud. Then blood serum were taken to detect the contents of the T-AOC, SOD, MAO and MDA. Liver were taken to detect the contents of the MAO, MDA and LF. At the same time, liver tissue made tissue slice. [Result] Fructus Chebulae and its different processed products can increase the contents of the T-AOC and SOD in mice’s blood serum, decrease the contents of the MAO and MDA in mice’s blood serum and liver, decrease the contents of the LF in mice’s liver, and made contributions to the liver’s protection. [Conclusion] Fructus Chebulae and its different processed products have the antioxidation to mice.

Key wordsFructus Chebulae; Processed products; Antioxidation

诃子(MedicineTerminaliaFruit)为使君子科植物，是一味清凉解毒的中药，其果实中含大量的鞣质(占干重的1/3)，以及多糖、多酚等物质，被誉为“藏药之王”[1]。鞣质具有强烈的自由基清除活性以及抗氧化活性。多糖与多酚等物质也能够清除动物体内自由基，抑制一些过氧化损伤，起到抗氧化的作用[2]。诃子还具有一定的药理价值，但诃子直接入药则利用率低，不能完全发挥其功效，因此需要对诃子进行炮制。孙虹祥[3]研究表明通过炮制可明显提高多种中药中有效成分的溶出度，从而增强其药理作用。诃子经过炒、煨等炮制后，鞣酸含量显著增高，可增强其抗氧化作用。

茜草与白狼毒为天然的中草药，均具有显著的抗氧化作用。茜草中的主要成分茜草双酯能保护异丙肾上腺素诱发的心肌缺血损伤，能够显著抑制自由基脂质过氧化作用，可以降低脂质过氧化物丙二醛(MDA)的产生，增加超氧化物歧化酶(SOD)的活性[4]。杨柯等[5]研究表明狼毒大戟提取液可以明显提高Lewis小鼠SOD、GSH-PX和CAT值，显示了狼毒较好地提高机体抗氧化能力的作用。该试验以诃子为研究对象，探究诃子的不同炮制方法及其抗氧化作用，对其藏医特殊炮制品(茜草制诃子和白狼毒制诃子)进行较为深入的研究，探明诃子及其不同炮制品对小鼠的抗氧化性，以拓宽诃子的临床应用范围，优化诃子的特殊炮制工艺，从而促进民族药品的开发和应用。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验动物。SPF小鼠体重为20 g±2 g，雌雄各半(购自成都达硕科技有限公司，合格证号SCXK(川)2008-24)。

1.1.2药物。诃子购自四川成都荷花池中药材市场(产地广西壮族自治区玉林市)；茜草购自四川成都荷花池中药材市场(产地四川省阿坝藏羌族自治州)；白狼毒购自茗居茶园(产地山东省烟台市)。上述药材均由四川农业大学生药学范巧佳副教授鉴定为正品药材，分别为君子科植物诃子(TerminaliachebulaRetz)、茜草科植物茜草(RubiacordifoliaL.)和大戟科植物白狼毒(EuphorbiafischerianaSteud)。

1.1.3试剂盒。总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒，批号20140626；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，批号20140621；丙二醛(MDA)试剂盒，批号20140626；单胺氧化酶(MAO)试剂盒，批号20140627；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，批号20140619；脂褐素(LF)试剂盒，批号20140628；以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2试验方法

1.2.1诃子不同炮制品的炮制。

1.2.1.1诃子的茜草制法。将茜草烧成白灰，按照1∶3的比例注入麦酒，搅拌，以稀稠如同酪浆为度，在锅中少许沸开，然后放入诃子(以被淹没为度)，接着快速灭火，在锅中浸泡1 d；第2天捞出诃子，在木臼中揉破，肉核分离；将诃子肉用蒸馏水刷洗3次，于50～70 ℃烘干[6]。

1.2.1.2诃子的白狼毒制法。取与诃子等重量的白狼毒，加水煎煮，榨取汁液，保存。将诃子放入此液中(淹没)，浸泡3 d，浸泡期间不要搅动，3 d后取出诃子，剥开取出核，将诃子肉放入上述白狼毒液中，小火烧煮，煮至汁液全部渗入诃子而干涸，于50～70 ℃烘干[7]。

1.2.2药品溶液的制备。取待测定样品诃子、茜草制诃子、白狼毒制诃子各10 g，加水200 ml浸泡过夜，煎煮 2 h，过滤；滤渣加水200 ml浸泡过夜，煎煮1 h，过滤。合并2次滤液，浓缩至20 ml(0.5 g生药/ml)，备用[8]。

1.2.3试验分组与给药。取昆明种SPF级小鼠110只，雌雄各半，随机分为11组，每组10只，分别为空白对照组、维生素E胶丸组(54 mg/kg)、原药诃子高剂量组(4 g生药/kg)、茜草制诃子高剂量组(4 g生药/kg)、白狼毒制诃子高剂量组(4 g生药/kg)、原药诃子中剂量组(2 g生药/kg)、茜草制诃子中剂量组(2 g生药/kg)、白狼毒制诃子中剂量组(2 g生药/kg)、原药诃子低剂量组(1 g生药/kg)、茜草制诃子低剂量组(1 g生药/kg)、白狼毒制诃子低剂量组(1 g生药/kg)。分组之后先对小鼠进行一周的饲养观察，若小鼠的精神状态、运动状态、食欲及饮欲等无异常，则可进行后续试验。各给药组按剂量灌胃给药，空白对照组给予等体积生理盐水，每天1次，连续14 d。末次给药后1 h，各组动物每只眼眶采血2 ml，分离血清备用。采血后小鼠处死，每只小鼠取肝左叶部位大致相同的一小块肝组织约0.5 cm3固定于Bone氏液中；再取小鼠肝脏右外叶，称重，冰浴下研磨成10%的肝脏匀浆液，2 000 r/min离心10 min，取上清液备用[9]。

1.2.4肝脏组织形态学观察。取Bouin氏液中固定24 h的肝脏组织，进行包埋，修块，石蜡连续切片，切片厚度4 μm，HE染色，作组织切片观察。

1.2.5测定生化指标。运用试剂盒测定血清中T-AOC、SOD、MAO、MDA的含量以及肝脏中MAO、MDA和LF的含量。

1.2.6统计学处理。试验数据均由SPSS 15.0软件统计，并用单因素方差分析试验组与对照组均数间差异的显著性。

2结果与分析

2.1诃子及其不同炮制品的不同剂量对小鼠血清中T-AOC、SOD、MAO、MDA含量的影响对小鼠血清中T-AOC、SOD、MAO、MDA含量进行测定，结果显示(表1)，原药诃子与诃子不同炮制品的不同剂量对小鼠血清中T-AOC、SOD、MAO、MDA的含量均有不同程度的影响。与空白对照组相比，原药诃子组(4、2、1 g生药/kg)、茜草制诃子组(4、2、1 g生药/kg)、白狼毒制诃子组(4、2、1 g生药/kg)的小鼠血清中T-AOC和SOD含量均显著升高，而MDA含量均明显降低；同时，原药诃子组(4、2 g生药/kg)、茜草制诃子组(4、2 g生药/kg)、白狼毒制诃子组(4、2 g生药/kg)的小鼠血清中MAO含量也明显降低；与同等剂量原药诃子组比较，各试验组小鼠血清中SOD、MAO和MDA的含量均无明显的变化。

表1　诃子及其不同炮制品的不同剂量对小鼠血清中T-AOC、SOD、MAO、MDA的影响

注：*表示与空白对照组相比差异显著(P<0.05)，**表示与空白对照组相比差异极显著(P<0.01)；△表示与同等剂量的原药诃子相比差异极显著(P<0.05)。

2.2诃子及其不同炮制品的不同剂量对小鼠肝脏中MAO、MDA和LF含量的影响对小鼠肝脏中MAO、MDA和LF的含量进行测定，结果显示(表2)，原药诃子与诃子不同炮制品的不同剂量对小鼠肝脏中MAO、MDA和LF的含量均有不同程度的影响。与空白对照组相比，原药诃子组(4、2、1 g生药/kg)、茜草制诃子组(4、2、1 g生药/kg)、白狼毒制诃子组(4、2、1 g生药/kg)肝脏中MAO与MDA含量明显降低，原药诃子组(4 g生药/kg)、茜草制诃子组(4、2 g生药/kg)、白狼毒制诃子组(4、2 g生药/kg)小鼠肝脏中LF含量明显下降；与同剂量原药诃子组比较，白狼毒制诃子中剂量组(2 g生药/kg)小鼠肝脏中LF的含量明显降低，其余各试验组小鼠肝脏中MAO、MDA和LF含量均无明显的变化。

2.3诃子及其炮制品对小鼠肝脏组织形态学的影响光镜下可见，在空白对照组中，肝小叶结构完整(图1a)，干细胞围绕中央静脉呈放射状排列，且干细胞大小正常，但肝小叶中央区的肝细胞可见大、中、小的空泡，肝细胞索结构较清晰(图1b)；VE胶丸组，肝小叶结构完整(图2a)，干细胞围绕中央静脉呈放射状排列，且肝细胞大小正常，肝细胞空泡变性情况较空白组轻(图2b)；白狼毒制诃子组，肝小叶结构完整(图3a1、b1、c1)，干细胞围绕中央静脉呈放射状排列，且干细胞大小正常，肝细胞空泡变性情况最轻(图3a2、c2)，其中白狼毒制诃子中剂量组(2 g生药/kg)肝细胞只见较小的空泡，且肝细胞索结构清晰(图3b2)；原药诃子组和茜草制诃子组，肝小叶结构较完整(图4a1、b1、c1，图5a1、b1、c1)，肝细胞可见中、小的空泡(图4a2、b2、c2，图5a2、b2)，其中原药诃子高剂量组(4 g生药/kg)肝细胞索结构较乱(图5c2)。

表2　诃子及其不同炮制品的不同剂量对肝脏中MAO、MDA和LF的含量影响

注：*表示与空白对照组相比差异显著(P<0.05)，**表示与空白对照组相比(P<0.01)；△表示与同等剂量的原药诃子相比差异显著(P<0.05)。

注：a.HE×100；b.HE×400。 图1　空白组肝脏组织切片

注：a.HE×100；b.HE×400。 图2　VE胶丸组肝脏组织切片

注：a 1、b 1、c 1为HE×100；a 2、b 2、c 2为HE×400。 图3　白狼毒制诃子低(a)、中(b)和高(c)剂量组肝脏组织切片

3讨论

3.1诃子及其不同炮制品的不同剂量对小鼠血清中T-AOC、SOD、MAO、MDA含量的影响T-AOC是用于衡量机体抗氧化系统功能状况的综合性指标，其大小可代表反应机体抗氧化酶系统和非酶促系统对外来刺激的代偿能力以及机体自由基代谢的状态。血浆T-AOC系统主要起防护氧化作用，它通过消除自由基、活性氧及分解过氧化物、阻断过氧化链，以免引发组织细胞脂质过氧化[10]。SOD是机体清除自由基的主要酶，SOD活性的高低间接反映机体清除自由基的能力[11]。试验中原药诃子和诃子的不同炮制品与空白组T-AOC、SOD相比均有显著升高，说明原药诃子与诃子的不同炮制品可以使机体中的T-AOC、SOD升高，使机体的抗氧化能力提高，清除自由基，从而延缓衰老的进程。

单胺氧化酶(MAO)广泛地分布于机体组织内，可以催化芳香族、脂肪族单胺类氧化脱氢基反应，同时，MAO也与衰老密切相关，当MAO活性增加，可能导致神经递质紊乱，大脑生理功能退化等，而抑制MAO的活性，可以起到抗衰老的作用[12]。试验中原药诃子组(4、2 g生药/kg)、茜草制诃子组(4、2 g生药/kg)、白狼毒制诃子组(4、2 g生药/kg)与空白组MAO相比均有明显降低，表明原药诃子及不同炮制品(4、2 g生药/kg)可以使机体中的MAO降低，起到抗衰老的作用。

丙二醛(MDA)是脂质过氧化的代谢产物，MDA含量可以反应机体脂质过氧化情况，间接反映机体细胞受损的程度[13]。如果MDA含量升高，表明机体脂质过氧化程度较高，机体细胞受损严重。试验中原药诃子组(4、2、1 g生药/kg)、茜草制诃子组(4、2、1 g生药/kg)、白狼毒制诃子组(4、2、1 g生药/kg)的小鼠血清中MDA与空白组相比均有明显降低，表明原药诃子和诃子不同炮制品可以延缓脂质过氧化，保护组织细胞。

3.2诃子及其不同炮制品的不同剂量对小鼠肝脏中MAO、MDA和LF含量的影响试验中原药诃子组(4、2、1 g生药/kg)、茜草制诃子组(4、2、1 g生药/kg)、白狼毒制诃子组(4、2、1 g生药/kg)小鼠肝脏中MAO与MDA含量与空白组相比明显降低，表明原药诃子和诃子不同炮制品可以减缓机体衰老，并保护肝细胞。

注：a 1、b 1、c 1为HE×100；a 2、b 2、c 2为HE×400。 图4　茜草制诃子低(a)、中(b)和高(c)剂量组肝脏组织切片

注：a 1、b 1、c 1为HE×100；a 2、b 2、c 2为HE×400。 图5　原药诃子低(a)、中(b)和高(c)剂量组肝脏组织切片

脂褐素(LF)又称老年斑，其含量与自由基含量呈正相关[14]。当肝脏中LF含量升高，表明机体内自由基含量增加。试验中原药诃子组(4 g生药/kg)、茜草制诃子组(4、2 g生药/kg)、白狼毒制诃子组(4、2 g生药/kg)小鼠肝脏中LF的含量与空白组相比明显下降，表明机体中自由基被清除，抗氧化能力有所提高。

3.3诃子及其炮制品对小鼠肝脏组织形态学的影响光镜下观察到白狼毒制诃子组(4、2、1 g生药/kg)肝细胞中空泡变性程度与空白组相比明显改善，表明白狼毒制诃子组对肝细胞具有一定保护作用，这与白狼毒制诃子组肝细胞中MDA含量明显降低、具有保护肝细胞作用相对应。与空白组相比较，原药诃子组(4g生药/kg)肝细胞索结构较为混乱，表明原药诃子组(4 g生药/kg)对肝细胞有一定损失作用。

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