微波辅助离子液体提取酸枣仁中黄酮的研究

微波辅助离子液体提取酸枣仁中黄酮的研究

李 敏， 王秀玲， 王力川， 王僧虎， 冯 敏， 李娟娟

(邢台学院化学工程与生物技术学院，河北邢台 054001)

摘要[目的] 研究离子液体和微波辅助提取技术相结合提取酸枣仁中黄酮类化合物。[方法]以[Bmim]Br、[Bmim]BF4、[Hmim]Br、[Hmim]BF4离子液为提取溶剂，微波辅助提取酸枣仁中的黄酮。用单因素变化法，依次改变提取剂种类、提取剂浓度、微波时间和液固比，根据提取的黄酮含量确定最佳提取条件。[结果]试验得到的最佳提取条件为：以[Hmim]Br 溶液为提取剂，离子液体浓度V[Hmim]Br/V乙醇为1∶6；提取时间15 min；液固比60∶1 ml/g。在此条件下，测定不同产地酸枣仁中的黄酮效果较好。[结论]与其他传统提取方法相比，微波提取技术和离子液体相结合的方法，在获得较高的提取率的同时，大大缩短了提取时间，节约资源，具有良好的应用前景。

关键词离子液体；微波辅助提取；酸枣仁；黄酮

中图分类号S609.9

基金项目河北省科技厅科技支撑项目(2014ZC104)；邢台学院专项课题(XTXY13ZX21)。

作者简介李敏(1982- )，女，河北沙河人，讲师，硕士，从事中草药分析研究。

收稿日期2015-08-05

Study on Extracting Flavonoids from Spine Date Seed in Ionic Liquid with Microwave-assisted

LI Min, WANG Xiu-ling, WANG Li-chuan et al (College of Chemical Engineering and Biotechnology,Xingtai College, Xingtai, Hebei 054001)

Abstract[Objective] To study the method of combining microwave extraction technology with ionic liquid to extract flavonoids from spine date seed. [Method] Using [Bmim]Br, [Bmim]BF4, [Hmim]Br, [Hmim]BF4 as extraction agent, extracting flavonoids of spine date seed with microwave-assisted. Changing the kinds of ionic liquids and concentrations of extractant, microwave time and liquid-solid ratio successively by single factors of method, the optimum conditions were determined according to the content. [Result] The optimum extraction conditions for testing were as follows: extractant is [Hmim]Br, concentration of ionic liquids, V[Hmim]Br/VEthanol is 1∶6, extraction time is 15 min, liquid-solid ratio is 60∶1 ml/g. Under these conditions, determining flavonoids of spine date seed in different areas is good. [Conclusion] Compared with other traditional methods, the method of combining microwave extraction technology with ionic liquid, in higher extraction rates at the same time, can greatly shorten the time, save resources and show good application prospects.

Key words Ionic liquid; Microwave-assisted extraction; Spine date seed; Flavones

酸枣仁为鼠李科植物酸枣[ZizyphusjujubaMill var.spinosa(Bunge.) HuexH.F.Chou.]的干燥成熟种子[1]，有养肝、安神、宁心、敛汗的效果，对惊悸多梦、虚烦不眠、体虚多汗、津伤口渴等病症有很好的医疗效果。酸枣仁主要成分有：黄酮类化合物、脂肪油、皂苷、蛋白质等，其中黄酮类化合物为主要有效成分[2-5]。黄酮类化合物是一种在自然界中广泛存在的多酚类植物次级代谢产物，可以抑制细胞的凋亡以及有效清除人体内的自由基，所以常用于治疗心血管疾病[6]。提取酸枣仁中黄酮类化合物的传统方法有很多：超声波辅助提取法、微波辅助提取法、溶剂提取法等。常用提取剂为有机溶剂，会造成环境污染；虽然超声波和微波辅助提取法优于溶剂提取的速度，但提取率仍然不高。万辉等用[Omim]BF4离子液体提取酚类化合物的研究[7]，都表明这种方法既快速高效又对环境无污染；与有机溶剂不同，离子液体是由阴离子和阳离子构成的一类结构复杂的极性溶剂[8-9]。

笔者采用的是离子液体和微波辅助提取技术相结合的方法，提取酸枣仁中黄酮类化合物。利用无挥发性的离子液体及其液程宽、溶解强并可设计调节的特性[10-11]与微波提取技术的提取速率快、提取率高、安全无污染等特性相结合，研究从酸枣仁中提取黄酮类化合物的新方法。

1材料与方法

1.1材料供试原料：酸枣仁，产地分别为邢台、山东、东南亚。主要仪器：FA2004电子天平，上海天平仪器技术有限公司；XH-100B型祥鹄电脑微波合成/提取仪，北京祥鹄科技发展有限公司；TD4-台式离心机，湖南仪器仪表总厂离心机厂；LC-20AT高效液相色谱仪(HPLC)，日本岛津。

主要试剂：无水乙醇、磷酸，分析纯；甲醇，色谱纯；槲皮素标准品(≥98%)；[Bmim]Br、[Bmim]BF4、[Hmim]Br、[Hmim]BF4离子液体，均为实验室合成，经检测含量在98% 以上。

1.2检测条件HPLC色谱条件为：采用WondaSilTM-C18柱(4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm)，流动相A和流动相B梯度洗脱，A为0.1% 磷酸溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序：0～5.5 min，45%～64% B；5.5～14.0 min，64% B；14.0～18.0 min，64%～45% B。流速：1.0 ml/ min；进样量：20 μl；检测波长：257 nm；柱温：34 ℃。

标准曲线：准确称取槲皮素标准品0.1 g，用少量离子液体溶解，转入100 ml容量瓶中稀释定容，摇匀，得到浓度为1 mg/ml槲皮素标准溶液。再稀释成 0.002 5、0.050 0、0.010 0、0.020 0、0.030 0 mg/ml 槲皮素标准溶液，采用HPLC法测定峰面积。以峰面积为纵坐标，槲皮素浓度为横坐标制作标准曲线。结果显示，槲皮素在2.500～30.000 μg/ml的范围内呈良好的线性关系，回归方程为：y=5×107x+29 001,R2=0.995 2，式中x为质量浓度(mg/ml)，y为峰面积。

1.3黄酮的提取方法把干燥的酸枣仁粉碎研磨，脱脂，在干燥箱内烘干，过60目筛(0.25 mm)，在干燥的条件下保存备用。准确称取 0.5 g 干燥的酸枣仁粉末，倒入100 ml三颈烧瓶中，加 15 mlV[Hmim]Br/V乙醇为1∶6的[Hmim]Br溶液，放入微波提取仪，在功率400 W，温度70 ℃条件下提取。

用乙醇提取：精确称取0.5 g干燥的酸枣仁粉末，放入100 ml三颈烧瓶中，加15 ml无水乙醇，在其他的提取条件和离子液体微波辅助提取相同的情况下，提取黄酮。

2结果与分析

2.1离子液体的合成采用两步法合成离子液体，先用1-甲基咪唑与卤代烷反应合成中间体溴盐(溴化1-烷基-3-甲基咪唑，烷基=正丁基、正己基，分别简记为 [Bmim]Br、[Hmim]Br)，第二步再将溴离子置换为目标产物的阴离子，合成系列离子液1-烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(烷基=正丁基、正己基，分别简记为 [Bmim]BF4、[Hmim]BF4)[13-16]。

2.2离子液体种类的选择以V[Hmim]Br/V乙醇为1∶6的[Bmim]Br、[Bmim]BF4、[Hmim]Br、[Hmim]BF4离子液体为提取剂，其他条件：液固比30∶1 ml/g，功率400 W，温度70 ℃，微波辐射5 min。不同离子液体对酸枣仁中黄酮的提取率的影响如图 1 所示。

试验数据表明，4种离子液中[Hmim]Br对黄酮的提取率最大，离子液体的阳离子结构相同时，阴离子对黄酮提取率影响的大小是Br->BF4-。阴离子结构相同，阳离子结构对黄酮提取率的影响更大，受阳离子影响的大小关系是[Hmim]+>[Bmim]+，这是由于[Hmim]+的碳链较[Bmim]+长，碳链越长非极性越强，从而有利于黄酮的提取率。

图1　离子液种类对黄酮提取率的影响

2.3离子液体浓度的选择分别以体积比V[Hmim]Br/V乙醇为1∶3、1∶6、1∶9、1∶15 的[Hmim]Br离子液溶液为提取剂，在条件为液固比30∶1 ml/g，微波功率400 W，温度70 ℃下提取时间5 min,结果如图2所示。由图2可见，离子液浓度V[Hmim]Br/V乙醇从1∶15增到1∶6时，离子液体对黄酮的提取率明显增大，当离子液浓度V[Hmim]Br/V乙醇从1∶6增加到1∶3时，提取率开始下降。原因是随着浓度V[Hmim]Br/V乙醇的逐渐增加，离子液体对微波的吸收和转换能力逐渐增强，酸枣仁中黄酮类化合物与离子液体间的相互作用增强，从而，加快了酸枣仁中黄酮类化合物的提取与溶解，因此，使黄酮的提取率大大提高。当离子液浓度继续增大时，离子液黏度较大，扩散能力差，提取率明显降低。因此，提取酸枣仁中黄酮的最佳离子液体浓度V[Hmim]Br/V乙醇为1∶6。

图2　离子液体浓度对黄酮提取率的影响

2.4提取时间的选择以液固比为30∶1 ml/g，浓度V[Hmim]Br/V乙醇为1∶6的离子液[Hmim]Br为提取溶剂，微波功率 400 W，温度70 ℃的条件下分别微波辐射3、5、9、15、20 min,不同提取时间对黄酮提取率的影响如图3所示。

从图3可以得出，微波提取时间从3 min 增加到15 min 时，黄酮的提取率不断增加，特别是9～15 min，提取率从0.013 6% 增加到了0.026 4%，提取率明显增加。这是由于微波辐射时间低于15 min时，酸枣仁中的黄酮提取不完全，随着辐射时间的不断增加，提取率不断升高。当提取时间为15 min时，提取率达到最大；微波辐射时间超过15 min时，酸枣仁中部分黄酮类化合物吸收能量过多，化学键被破坏，导致黄酮的提取率逐渐降低。所以，提取酸枣仁中黄酮的微波辅助提取的最佳辐射时间为15 min。

图3　提取时间对黄酮提取率的影响

2.5液固比的选择以体积比V[Hmim]Br/V乙醇为1∶6，液固比分别为20∶1、30∶1、50∶1、60∶1、70∶ 1 ml/g，微波功率400 W，温度70 ℃ 的条件，微波辐射15 min,不同液固比对黄酮提取率的影响如图4所示。由图4可见，随着液固比从20∶1 ml/g增加到60∶1 ml/g，黄酮的提取率不断升高，尤其是液固比从50∶1 ml/g增加到60∶1 ml/g时，黄酮的提取率增长很明显，液固比超过60∶1 ml/g以后，黄酮的提取率开始降低。这是因为随着液固比的不断增加，酸枣仁样品与[Hmim]Br 离子液溶液的接触越来越充分，黄酮类化合物在离子液中溶解越充分。所以，黄酮的提取率随着液固比的增加而不断提高。当液固比超过60∶1 ml/g时，由于增大的溶剂用量对微波能量的吸收增加，从而使植物细胞吸收微波能量的能力减少，细胞壁不能完全破裂，细胞中的黄酮不能很好地溶出，从而黄酮的萃取率降低。因此，提取酸枣仁中黄酮的提取剂最合适的液固比为60∶1 ml/g。

图4　不同液固比对黄酮提取率的影响

2.6离子液体于乙醇溶剂提取率比较在相同条件：液固比60∶1 ml/g，微波功率400 W，温度70 ℃下,分别用无水乙醇和浓度V[Hmim]Br/V乙醇为1∶6的离子液[Hmim]Br微波辐射15 min,2种提取剂对黄酮提取率的影响如图5所示。由图5可见，离子液体对酸枣仁中黄酮类化合物的提取率是0.019 8%，而无水乙醇对酸枣仁中黄酮类化合物的提取率仅是0.007 1%。研究表明，离子液体对酸枣仁中黄酮类化合物的提取率远远高于无水乙醇。其原因是离子液体具有特殊的结构，它的特殊性质可以使黄酮物质更好地从酸枣仁基质中溶解出来。所以，选用离子液体作为提取剂更合适。

图5　无水乙醇与离子液对黄酮提取率的影响

3结论

该研究选用离子液微波辅助法探索提取酸枣仁中的黄酮类化合物的最佳条件，考察了离子液体种类、离子液体浓度、提取时间及液固比对黄酮类化合物提取率的影响。对试验数据研究发现，咪唑类离子液微波提取酸枣仁中的黄酮类化合物的最合适的提取条件是：离子液种类[Hmim]Br、离子液浓度V[Hmim]Br/V乙醇=1∶6、微波辐射时间15 min、液固比60∶1 ml/g,在此条件下，与传统溶剂乙醇相比较，离子液体表现出了良好的提取效果，为离子液体在酸枣仁有效成分的提取中提供了依据。

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