HSP90α/β蛋白在胃癌组织中的表达及临床意义

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(1.南华大学医学院肿瘤研究所；肿瘤细胞与分子病理学湖南省高校重点实验室，湖南 衡阳 421001； 2.郴州市第一人民医院中心医院消化内科；3.南华大学附属第二医院耳鼻喉科； 4.邵阳医学高等专科学校附属医院病理科；5.南华大学附属南华医院疼痛科)

HSP90α/β蛋白在胃癌组织中的表达及临床意义

雷艳1,2,张志伟1*,刘重元1,肖娟3,张先锋3,伍石华4,周华茂5

(1.南华大学医学院肿瘤研究所；肿瘤细胞与分子病理学湖南省高校重点实验室，湖南 衡阳 421001； 2.郴州市第一人民医院中心医院消化内科；3.南华大学附属第二医院耳鼻喉科； 4.邵阳医学高等专科学校附属医院病理科；5.南华大学附属南华医院疼痛科)

目的观察热休克蛋白90α/β(heat shock protein 90α/β，HSP90α/β)在胃癌组织中的表达及临床意义，为胃癌的早期诊断与分子病理分型提供有价值的实验资料。方法采用免疫组织化学染色结合组织芯片，观察HSP90α/β蛋白质在正常胃黏膜组织、癌旁组织及胃癌组织中的表达；然后分析HSP90α/β蛋白质在胃癌组织中表达的临床意义。结果免疫组织化学染色结果显示，胃癌组织中HSP90α/β蛋白质表达的阳性率高于正常胃黏膜组织和癌旁组织(P<0.05)；癌旁组织中表达的阳性率高于正常胃黏膜组织(P<0.05)；淋巴结转移患者组织中表达的阳性率高于无淋巴结转移者(P<0.05)；Ⅲ～Ⅳ期患者组织中表达的阳性率高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)。结论HSP90α/β蛋白质的表达与胃癌组织的发生、分化程度、淋巴结转移及TNM分期有关，即随着胃癌组织分化程度的降低、淋巴结转移的发生及TNM分期的增加而表达升高。

胃癌； HSP90α/β蛋白质； 临床意义

胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤，其发病率居消化道肿瘤第一位[1]。内镜检查及活检是目前胃癌诊断的主要方法之一，但因早期胃癌临床症状不典型，许多患者就诊时已为胃癌晚期，致使患者临床预后差，因此早期诊断仍是防治胃癌的关键。至今，一些胃癌相关的蛋白质分子被不断的揭示，如CEA、CA19-9和CA72-4等，为早期胃癌的诊断提供了可能[2]。本课题组前期应用定量蛋白质组学技术筛选获得了238个胃癌相关差异表达蛋白质[3-4]，从中选取差异倍数大的胃癌相关蛋白HSP90α/β进行检测与分析，为胃癌的早期诊断提供实验资料。

1 材料与方法

1.1病例资料组织芯片(包括正常胃黏膜组织、癌旁组织及胃癌组织)由湘潭市第一人民医院病理科赠送。该组织芯片包括自2003年～2009年湘潭市第一人民医院胃癌患者手术切除标本81例，其中女性25例，男性56例，患者平均年龄为55岁(27～81岁)；49例胃癌肿块>3.0 cm，32例≤3.0 cm；胃癌组织包括胃高分化腺癌5例、中分化腺癌17例、低分化腺癌59例；无淋巴结转移者26例、淋巴结转移者55例；根据WHO的TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期49例。组织芯片中正常胃黏膜组织对照为34例胃癌患者距癌灶10 cm以上胃黏膜组织。胃癌组织芯片包括5×10个点阵，芯片中最底一排的右侧最后一孔为空白标记孔，以确定组织排列的方向。上述所有组织均经病理确诊，所有患者术前均未进行化、放疗。

1.2主要试剂抗HSP90α/β蛋白抗体购自美国Santa Cruz公司；DAB显色试剂盒和S-P免疫组织化学染色试剂盒购自福建迈新生物技术有限公司。

1.3免疫组织化学染色检测蛋白质的表达采用免疫组织化学染色法(S-P法)观察HSP90α/β蛋白质在正常胃黏膜组织、癌旁组织和胃癌组织中的表达，实验设立阳性对照(由福建迈新生物有限公司提供)和阴性对照(PBS替代一抗体)，步骤如下：(1)将组织芯片置于二甲苯中充分脱蜡，不同浓度的酒精水化。(2)将组织芯片置于0.01 mol/L枸椽酸盐缓冲液(pH6.0)中92～98 ℃ 5 min。(3)滴加3%过氧化物酶37 ℃ 15 min。(4)滴加非免疫的动物血清封闭37 ℃ 10 min。(5)滴加一抗(1∶1 000)4 ℃过夜。(6)滴加二抗(1∶2 000)37 ℃ 15 min。(7)滴加链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶溶液37 ℃ 15 min。(8)DAB显色后，复染、透明、封片，显微镜下观察与蛋白质在不同组织中的表达情况。

1.4不同组织中HSP90α/β蛋白质表达结果的判定显微镜下观察HSP90α/β蛋白质的表达部位与染色情况，蛋白质阳性表达显示强度分为黄色、棕褐色。随机选取组织芯片中每例组织的5个不同高倍镜视野，记数每个视野中总细胞数与蛋白质阳性表达细胞数，重复计数3次，取平均值作为细胞数，计算不同组织中HSP90α/β蛋白质的阳性表达率。不同组织中HSP90α/β蛋白质表达结果的判定，根据显色的强度与组织中细胞的阳性表达率综合计分。显色强度计分为：无显色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分；细胞阳性表达率计分为：≤10%为1分；11%～50%为2分；≥50%为3分。将显色强度分值×细胞阳性表达率分值所得数据，其中1分为阴性“-”；2～5分为阳性“+”，≥6分为强阳性“+++”，另外细胞阳性表达率>l0%者也为蛋白质表达阳性。

1.5统计学处理所有数据采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，采用χ2检验和方差分析蛋白质表达与临床资料的关系，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1免疫组织化学染色观察HSP90α/β蛋白质的表达采用免疫组织化学染色观察组织芯片中HSP90α/β蛋白质在正常胃黏膜组织、癌旁组织及胃癌组织中的表达，结果显示HSP90α/β蛋白质主要在细胞浆中表达(图1)。

2.2 HSP90α/β蛋白质在胃癌组织中的表达分析HSP90α/β蛋白质在正常胃黏膜组织、癌旁组织及胃癌组织中的阳性表达率分别为11.76%(4/34)、30.77%(8/26)和65.43%(53/81)。胃癌组织中HSP90α/β蛋白质的阳性表达率高于正常胃黏膜组织和癌旁组织，癌旁组织中该蛋白质的阳性表达率高于正常胃黏膜组织(表1，P<0.05)。高、中和低分化腺癌中该蛋白质的阳性表达率分别为40.00%(2/5)、58.82%(10/17)和69.49%(41/59)。患者无淋巴结转移与淋巴结转移的胃癌组织中阳性表达率分别为42.31%(11/26)和69.09%(38/55)，淋巴结转移者该蛋白的阳性表达率高于无淋巴结转移者(表1，P<0.05)。胃癌组织中Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期阳性表达率分别为56.25%(18/32)和79.59%(39/49)，Ⅲ～Ⅳ期患者组织中该蛋白的阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期(表1，P<0.05)。结果显示，随着胃癌分化程度的降低、淋巴结转移的发生及TNM分期的增加，HSP90α/β蛋白质的阳性表达率则升高。

图1 免疫组织化学染色观察HSP90α/β蛋白质的表达(400×) A：正常胃黏膜；B：癌旁组织；C：高分化腺癌；D：中分化腺癌；E：低分化腺癌

表1HSP90α/β蛋白质的阳性表达分析

指标nHSP90α/β蛋白质表达-+～+++阳性率(%)χ2性别男性56263053．57女性25121352．00正常胃黏膜3430411．76癌旁组织2618830．77a4．12胃癌组织高分化腺癌53240．00a5．36中分化腺癌1791058．82a10．47低分化腺癌59194169．49ab27．83，10．44肿块大小﹥3．0cm49173265．31≤3．0cm32112165．66淋巴结转移无26151142．31有55173869．09c5．3TNM分期Ⅰ～Ⅱ32131856．25Ⅲ～Ⅳ49103979．59d4．3

与正常胃黏膜组织比较，a：P<0.05；与癌旁组织比较，b：P<0.05；与无淋巴结转移比较，c：P<0.05；与TNM分期Ⅰ～Ⅱ期比较，d：P<0.05

3 讨 论

胃癌的发生、发展涉及多基因参与、多阶段演进的复杂病理学过程。随着蛋白质组学技术的不断更新，许多未知胃癌相关蛋白质不断被发现，为寻找胃癌早期诊断的蛋白质提供了大量的资料，使获得胃癌早期诊断的分子标志物提供了可能。目前已有许多胃癌相关的蛋白质分子已经被证实，如CA19-9[5]、CEA[6]、Span-1[7]等，但是至今仍无用于胃癌早期诊断的蛋白质。本课题组前期采用显微切割与定量蛋白质组学技术相结合，筛选获得了一系列胃癌相关的蛋白，选取其中差异倍数较大且胃癌相关的蛋白质HSP90α/β，分析该蛋白质在胃癌中的表达情况及临床意义，为胃癌的早期诊断及预后评估等提供有价值的实验资料。

1962年，Ritossa在研究果蝇唾液腺时发现，热应激环境下大部分蛋白质合成均被抑制，但有一组特殊蛋白质合成却被激活，即热休克蛋白(heat shock protein，HSP)[8]。有研究表明HSP与肿瘤的发生、发展、耐药及预后关系密切，许多研究证实HSP在乳腺癌、肺癌、结直肠癌、鼻咽癌等组织中均高表达，该蛋白对肿瘤的诊断和预后评估具有重要的意义[9-10]。热休克蛋白90α/β(heat shock protein 90α/β，HSP90α/β)属于热休克蛋白家族成员之一，普遍存在于各物种中，其蛋白质结构高度保守，为细胞生存所必需的分子伴侣(molecular chaperon)蛋白之一[11]。HSP90蛋白分子量约 90kD，是一种疏水性蛋白，常以二聚体形式存在并发挥作用，应激情况下该蛋白的疏水性增加形成寡聚体。HSP90蛋白作为分子伴侣，具有广泛的蛋白结合谱，如激酶、磷酯酶、热休克因子-1、多种核受体、钙调素、肌动蛋白、蛋白酶体、微管蛋白和钙激活蛋白酶等[12]。HSP90蛋白可在应激(几乎所有细胞理化环境改变及机体的疾病与创伤)情况下被诱导性高表达，其功能具有在应激条件下纠正细胞内蛋白质发生的错误折叠，对细胞应激过程中具有重要的保护作用。HSP90蛋白作为分子伴侣，通过低亲和力的结合与解聚，维持相关蛋白质的稳定构象，参与蛋白质折叠、装配、转位与损伤修复等，使细胞信号分子形成与维持正确构象发挥细胞内信号传导功能[13]。另外，HSP90蛋白质也参与细胞周期、细胞凋亡等调控过程[14-16]。本结果显示，胃癌组织中HSP90α/β蛋白质表达水平较正常胃黏膜组织与癌旁组织高，且低分化胃癌组织较高分化胃癌组织阳性表达率高，以及癌旁组织较正常胃黏膜组织高，结果与以往许多研究者在多种肿瘤中的基本一致，根据HSP90α/β蛋白质作为分子伴侣，参与正常细胞与肿瘤细胞中的多种信号途径的传递，参与细胞周期、凋亡等多种功能，结合本实验结果，推测HSP90α/β蛋白质的高表达在胃黏膜癌变过程发挥着重要的生物学功能，该蛋白的高表达对维持细胞内众多蛋白分子的稳定生物学功能尤为重要，尤其是涉及细胞增殖、凋亡与细胞周期的蛋白质。深入揭示HSP90α/β蛋白质在胃癌中的调控分子机制，对阐明胃癌发病的分子机制可能具有非常重要的意义。HSP90α/β蛋白有望成为胃癌早期诊断、治疗与临床预后评估分子标记物，以及胃癌治疗时非常有效的分子靶标。

总之，本研究结果初步分析了HSP90α/β蛋白质在胃癌组织中的表达情况，为后续寻找胃癌早期诊断、治疗及临床预后评估的分子标记物提供了有价值的实验资料，然而，基于胃癌发生与发展的复杂性和不同个体间的遗传学差异，且本研究时样本量小，因此临床采用前仍需后续大样本的进一步分析与评估。

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TheClinicalSignificanceandExpressionofHSP90α/βProteininGastricCancerTissue

LEI Yan,ZHANG Zhiwei,LIU Zhongyuan,et al

(CancerResearchInstitute,UniversityofSouthChina;KeyLaboratoryofCancerCellularandMolecularPathologyinHunanProvince,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo verify clinical significance of the expression of heat shock protein 90α/β (HSP90α/β) protein in gastric cancer tissue and provide valuable experiment data for gastric cancer patients on early diagnosis and clinical pathology grouping.MethodsThe expression of HSP90α/β protein was observed by immunohistochemistry staining in normal gastric mucosa tissue,cancer side tissue and gastric cancer tissue.Then the clinical pathology significance of the expression of HSP90α/β protein was analyzed.ResultsThe immunohistostaining results showed that the expressin positive rate of HSP90α/β protein was higher in gastric cancer tissue than that in normal gastric mucosa and cancer side tissue (P<0.05),in cancer side tissue than that in normal gastric mucosa tissue (P<0.05),in lymphaden metastatic gastric cancer tissue than that in no lymphaden metastatic gastric cancer tissue (P<0.05) and inⅢ～Ⅳperiod patient gastric cancer tissue than that in Ⅰ～Ⅱperiod (P<0.05).ConclusionThe expression of HSP90α/β protein was related with gastric cancer effluence,gastric cancer differentaiation level,lymphaden metastasis and TNM classification of gastric cancer.As the differentaiation level of gastric cancer tissue decreased,lymphaden metastasis of gastric cancer and TNM classification increased,the expression rate of HSP90α/β protein was also heightened.

gastric cancer; HSP90α/β protein; clinical significance

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.06.003

2015-06-11；

2015-10-25

湖南省自然科学衡阳联合基金(No.12JJ9033)；湖南省自然科学基金(No.13JJ3079)；湖南省科技厅项目(No.2013SK3118;2014SK3081;2014sk3073)；湖南省高校创新平台基金(No.12K094、No.13K082)；衡阳市科技局项目(2013KJ02;2013KJ12;2013KJ28).

*通讯作者，E-mail：nhdxzzw@qq.com.

R735.2

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(此文编辑：蒋湘莲)