荧光猝灭法测定鱼肉中苯胺绿含量*

毛永强，刘艳，杨森，李娜

(辽宁工程技术大学 理学院，辽宁阜新，123000)

苯胺绿(aniline green，AG)别名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿、维多利亚绿或中国绿，曾作为驱虫剂和杀菌剂在水产养殖业中预防与治疗鱼的水霉病、鳃霉病等。但苯胺绿易在鱼体内累积，可通过食物链进入人体，对人体具有致癌、致畸、致突变等毒副作用［1-2］，因此包括美国、日本、中国等在内的许多国家都将其列为禁用药物。目前苯胺绿含量的检测方法主要有紫外光谱法［3］、荧光光谱法［4］、液相色谱法［5］、液相色谱-质谱联用法［6-7］、酶联免疫吸附法［8］、化学传感器［9］等，但这些方法过程复杂、操作耗时，难以普及推广应用，因此建立一种成本低廉、快速检测苯胺绿含量的方法具有重要现实意义。

近些年，荧光分光光度法因具有操作简便、选择性好、灵敏度高等优点而倍受关注，量子点(quantum dots，QDs)作为一种新型的荧光纳米探针，弥补了传统有机染料的一些缺陷，已经广泛应用于致病菌［10-11］、生物毒素［12-13］、农药残留［14-15］、兽药残留［16-17］和重金属［18-19］等食品安全检测领域。

本文以巯基乙酸为稳定剂，采用水热法制备CdTe量子点，基于苯胺绿对CdTe量子点荧光强度的猝灭作用，建立一种荧光分光光度法测定苯胺绿含量的新方法。该方法简单快速、灵敏度高，已用于鱼肉中苯胺绿含量的测定。同时对反应机理进行初步探讨，发现苯胺绿与CdTe量子点构建荧光共振能量转移体系所致。

1 实验

1.1 仪器与试剂

F-4500型荧光分光光度计(日本日立公司);UV-3010型紫外-可见分光光度计(日本日立公司);AUX320型电子分析天平(日本岛津公司);pHS-3C型pH计(上海精密科学仪器有限公司);DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司);KQ-50DB型数控超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司)，3-30K高速台式冷冻离心机(德国西格玛有限公司)。

苯胺绿(AG)，购于阿法埃莎化学有限公司;碲粉(Te)，天津市科密欧化学试剂开发中心;硼氢化钠(NaBH4)，国药集团化学试剂公司;巯基乙酸(TGA)，百灵威科技有限公司，氯化镉(CdCl2·2.5H2O)，天津市科密欧化学试剂开发中心;所用其他试剂均为分析纯;实验用水为二次蒸馏水。

1.2 CdTe量子点的制备

采用水热法制备巯基乙酸修饰的CdTe量子点［20］。准确称取43 mg碲粉和80 mg NaBH4于10 mL比色管中，加入5 mL蒸馏水溶解后，通氮除氧10 min，磁力搅拌下反应至溶液澄清透明，生成NaHTe前驱体溶液。在250 mL三口烧瓶中加入0.285 g CdCl2，100 mL蒸馏水溶解后加入230 μL巯基乙酸溶液，用1 mol/L的NaOH溶液调节溶液pH值为11.0;在氮气保护和剧烈搅拌条件下，加入新制备的NaHTe溶液，100℃加热回流反应2 h，得到实验所需的CdTe量子点。CdTe量子点浓度以溶液中Cd2+浓度计算。

1.3 测定方法

在5 mL比色管中，依次加入1.0 mL CdTe量子点溶液、3.0 mL pH值6.0的Tris-HCl缓冲溶液和一定量的苯胺绿溶液，蒸馏水定容到刻度，混匀。室温下放置5 min后，在激发波长330 nm、发射波长518 nm条件下(激发和发射狭缝宽度均为5 nm)，测定体系的荧光强度F。以不加苯胺绿的溶液为空白，测定其荧光强度F0，计算体系荧光猝灭强度△F=F0-F。

2 结果与讨论

2.1 CdTe量子点和苯胺绿作用的荧光光谱图

在5.0 mL比色管中分别加入相同量的水溶液和苯胺绿溶液，同时加入CdTe量子点溶液和Tris-HCl缓冲溶液，反应一段时间后测定体系的荧光强度，考察CdTe量子点溶液加入苯胺绿溶液前后的荧光光谱性质(如图1与图2所示)。结果发现，CdTe量子点的激发光谱宽而连续，最大荧光发射峰位于513 nm。当CdTe量子点溶液中加入苯胺绿溶液后，CdTe量子点的荧光强度显著降低;且随着苯胺绿浓度的增加，CdTe量子点的荧光强度逐渐降低，但荧光发射峰位保持不变，这说明苯胺绿对CdTe量子点荧光强度具有很强的猝灭作用。

图1 CdTe量子点的激发光谱(a)和发射光谱(b)Fig.1 Excitation spectrum(a)and emission spectrum(b)of CdTe QDs

图2 不同浓度苯胺绿存在时CdTe量子点荧光光谱的变化Fig.2 Fluorescence emission spectrum of CdTe QDs in the presence AG with various concentrations，the concentration of AG from a to k:0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0(μmol/L);cCdTe=4.5 ×10-6mol/L;pH=6.0;t=5 min

2.2 反应介质及其pH值对体系荧光强度的影响

考察 Tris-HCl、Na2CO3-NaHCO3、柠檬酸-柠檬酸钠等缓冲溶液对体系荧光猝灭强度的影响。结果发现，在Tris-HCl缓冲溶液中，体系荧光猝灭强度最大且稳定，因此实验选择Tris-HCl缓冲溶液调节体系的酸碱度。同时在5.0 mL比色管中加入CdTe量子点溶液和苯胺绿溶液，分别加入不同pH值Tris-HCl缓冲溶液，反应一段时间后测定体系的荧光强度，考察缓冲溶液pH值对体系荧光猝灭强度的影响(如图3所示)。结果发现，当pH值在5.0～6.0内，体系荧光猝灭强度随pH值升高而迅速增加;但当pH值大于6.0时，体系荧光猝灭强度逐渐降低。因此实验选择Tris-HCl缓冲溶液pH值为6.0。

图3 pH值对体系荧光猝灭强度的影响Fig.3 Effect of pH value on fluorescence quenching intensity of CdTe QDs in the presence of AG cCdTe=4.5×10-6 mol/L;cAG=5.0 μmol/L;t=5 min

2.3 CdTe量子点浓度对体系荧光强度的影响

在5.0 mL比色管中分别加入不同浓度的CdTe量子点溶液，同时加入Tris-HCl缓冲溶液和苯胺绿溶液，反应一段时间后测定体系的荧光强度，考察CdTe量子点浓度对体系荧光猝灭强度的影响(图4)。

图4 CdTe浓度对体系荧光猝灭强度的影响Fig.4 Effect of CdTe concentration on fluorescence quenching intensity of CdTe QDs in the presence of AG cAG=5.0 μmol/L;pH=6.0;t=5 min

结果发现，随着CdTe量子点浓度的增加，体系荧光猝灭强度逐渐增大，当增大到4.5×10-6mol/L时体系荧光猝灭强度达到最大值;继续增加CdTe量子点浓度，体系荧光猝灭强度反而逐渐降低。因此实验选择CdTe量子点浓度为4.5×10-6mol/L。

2.4 反应时间对体系荧光强度的影响

在5.0 mL比色管中分别加入CdTe量子点溶液、Tris-HCl缓冲溶液和苯胺绿溶液，反应不同时间后测定体系的荧光强度，考察反应时间对体系荧光猝灭强度的影响(如图5所示)。结果发现，当CdTe量子点溶液加入苯胺绿溶液后，体系荧光猝灭强度迅速增大，反应5 min后趋于稳定，且在25 min内保持不变。因此实验选择反应5 min后测定体系的荧光强度。

图5 反应时间对体系荧光猝灭强度的影响Fig.5 Effect of time on fluorescence quenching intensity of CdTe QDs in the presence of AG cCdTe=3.5×10-6mol/L;cAG=5.0 μmol/L;pH=6.0

2.5 工作曲线、相关系数与检出限

在最佳实验条件下，在5.0 mL比色管中分别加入不同浓度的苯胺绿溶液，同时加入CdTe量子点溶液和Tris-HCl缓冲溶液，反应5 min后测定体系的荧光强度，以体系荧光猝灭强度(△F)对苯胺绿浓度(c)作图(如图6所示)。

图6 标准曲线Fig.6 Standard curve

结果发现，苯胺绿浓度在1.0～10.0 μmol/L内与体系荧光猝灭强度呈良好的线性关系，线性回归方程为△F=13.488c+0.295 5，相关系数r为0.999 3，检出限为0.018 μmol/L。同时对5.0 μmol/L 的苯胺绿溶液进行11次平行测定，相对标准偏差为2.2%。

2.6 干扰实验

在最佳实验条件下，当苯胺绿浓度为1.0 μmol/L时，考察鱼肉中常见物质对苯胺绿含量测定的影响。结果发现，在±5%相对误差允许范围内，500倍的 K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、NO3-、Cl-、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-脯氨酸、L-半胱氨酸、L-甘氨酸、葡萄糖、VC、VE，几乎对测定结果不造成干扰，表明该方法具有较好的选择性。

2.7 样品测定与回收率实验

鲤鱼、鲫鱼、鲢鱼、青鱼、草鱼等购自当地市场，经剖杀后去除头、骨、内脏，取肌肉部分切成小块状，用电动绞肉机打成浆状。分别称取捣碎的鲤鱼、鲫鱼、鲢鱼、青鱼、草鱼等鱼肉样品10.0 g于50 mL离心管中，加入5 mL乙腈，超声水浴提取5 min，涡旋振荡提取3 min，8 000 r/min转速离心10 min后，上清液转移至10 mL容量瓶中;用5 mL乙腈将残渣按上述操作再提取1次，合并上清液，用乙腈定容，摇匀备用。用5 mL乙腈活化中性氧化铝萃取柱，氮气吹干;准确转移提取液10 mL到中性氧化铝萃取柱上，100 mL茄形瓶接收流出液;再用5 mL乙腈洗涤中性氧化铝柱，收集全部流出液，于45℃旋转蒸发至近干;残渣用2 mL等体积比乙腈和5 mol/L乙酸铵混合溶液溶解，超声振荡清洗5 min，经0.22 μm有机相滤膜过滤，滤液供荧光测定。

吸取一定量待测液，按照实验方法对10份鱼肉样品进行检测，为考察该方法的可靠性，同时对其进行加标回收试验(如表1所示)。结果发现，其中鲤鱼、青鱼2份样品中检出结晶紫，含量在3.7～4.2 nmol/kg，表明市售鲜鱼存在滥用结晶紫的情况;同时鱼肉样品中苯胺绿的加标回收率在97.6%～103.2%，相对标准偏差均小于2.3%，表明该方法具有较好的准确度和精密度。

表1 鱼肉样品中苯胺绿含量测定与回收率实验(n=6)Table 1 Analytical results of AG in fish muscle samples and recovery test(n=6)

2.8 反应机理探讨

采用荧光光谱法和紫外可见吸收光谱法，考察CdTe量子点的荧光发射光谱和苯胺绿的紫外-可见吸收光谱(如图7所示)。结果发现，CdTe量子点荧光发射峰位于513 nm处，而苯胺绿吸收光谱在616 nm处有最大吸收峰，且与CdTe量子点荧光发射光谱在450～600 nm内有相当程度的重叠;同时在pH值6.0条件下，巯基乙酸修饰的CdTe量子点表面带负电荷，而苯胺绿是带正电荷的三苯甲烷类阳离子染料，二者可通过静电引力而结合，从而发生有效的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)。因此当苯胺绿加入 CdTe量子点溶液后，苯胺绿能够吸收CdTe量子点的荧光发射能量，导致CdTe量子点荧光强度逐渐降低，从而建立一种测定苯胺绿含量的荧光分析法。

图7 CdTe量子点的荧光发射光谱(a)和苯胺绿的紫外-可见吸收光谱(b)Fig.7 Emission spectrum(a)of CdTe QDs and UV-Vis absorption spectrum(b)of AG

3 结论

采用水热法制备巯基乙酸修饰的CdTe量子点，基于苯胺绿对CdTe量子点荧光强度的猝灭效应，建立一种荧光测定苯胺绿含量的新方法。该方法简单快速、成本低廉、选择性好、灵敏度高，能用于测定鱼肉中苯胺绿含量，其回收率在97.6% ～103.2%，将为苯胺绿含量的快速检测提供一种参考方法。

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