传统豆糁品质特征分析*

王涵欣，乔发东，张春江，张泓，刘孟健，郭昕

1(河南工业大学生物工程学院，河南郑州，450001)

2(中国农业科学院农产品加工研究所农业部农产品加工综合性重点实验室，北京，100193)

豆糁(豆酱团)是河南省东部民间制作的一种传统发酵豆制品，其口感醇香、味道鲜美，深受豫东百姓的喜爱。它不仅是一种调味品，还是餐桌上的佐菜，尤其是春节等节假日时，用以解油腻，在人们的日常饮食中占有重要地位。豆糁以大豆为主要原料，经微生物作用自然发酵而成，具有独特的风味和营养功效。在大豆发酵制品的制作过程中，由于微生物对原料的分解、微生物的自溶以及代谢产物之间的相互作用，会发生复杂的发酵代谢和生化反应(醇发酵、酸发酵、酯化反应、美拉德反应等)形成复杂的风味物质，菌种、工艺不同，产品物质变化也有差异［1-4］。

目前，对豆糁这一区域性特色发酵豆制品的营养品质，尤其对其风味成分的分析比较少。顶空固相微萃取(HS-SPME)是一种新的挥发性物质采样技术［3］，通过吸附/脱附技术，能够富集样品中的挥发和半挥发性成分，具有灵敏度高、重现性及线性好、操作简单方便快速的优点，已被广泛应用于食品风味测定中［5-7］。本文测定了豆糁的理化指标，分离鉴定了其挥发性风味化合物，分析豆糁的品质特征。旨在为该传统产品的标准化和工业化生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

原料:大豆、面粉、食盐、香辛料等。

试剂:检验分析常用的各种化学试剂(分析纯)。

仪器与设备:电热鼓风干燥箱(BGZ-240电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司);水分活度仪(AQUA，美国Aqua Lab公司);pH计(PB-10);磁力搅拌器(78-1，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司);全自动凯氏定氮仪(KJELTEC 2300，丹麦FOSS公司);索氏提取器(SER148型脂肪测定仪);SPME萃取装置(50/30 μm DVB/CAR/PDMS，美国 Supelco公司);气相色谱-质谱联用仪(QP2010日本岛津公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程及操作要点

原料筛选→浸泡→蒸煮→裹面→制曲→拌料→发酵成熟

选择颗粒饱满、均匀、新鲜、无霉烂、无虫蛀的大豆，并且进行清洗、除杂及上浮物。然后放入容器中加水浸泡(20～25℃，10 h)，以豆内无白心，用手捏容易成2瓣为宜。采用常压煮制法(大火40 min，小火20 min)使大豆全部均匀熟透，既软又不烂，保持整粒又无夹心。以豆面质量比3∶2的比例进行裹面，并保持裹面后呈松散的颗粒状;按传统工艺方法制曲(25～35℃，3～4 d，每天翻曲1次)，至豆粒表面生长出浓密的黄绿色的菌丝及孢子后，移至阳光下晾晒1～2 d，去除表面多余的浮曲。

根据个人口感和喜好，加入适量的食盐水(14% ～15%)、辣椒、十三香等(也可加入其它的调味料)进行拌料。然后，在自然阳光下曝晒，每4～5 d搅拌1次，持续一个月后将豆糁团成圆形，继续晾晒至表面微干后，在室温条件下储存，完成后熟过程。

取样:分别选取3月份、5月份制作的豆糁为样品1和样品2进行理化和挥发性化合物分析。

1.2.2 理化指标与分析方法

水分含量(GB 5009.3-2010);水分活度(GB/T 23490-2009);食盐含量(GB/T 9695.8-2008);总酸含量(GB/T 5009.39-2003);氨基态氮含量(GB/T 5009.39-2003);蛋白质含量(GB 5009.5-2010);脂肪含量(索氏提取法);还原糖含量(DNS法)。

1.2.3 挥发性化合物分析

1.2.3.1 顶空固相微萃取条件

萃取头老化:初次使用时，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头在气相色谱进样口270℃老化1 h。

将豆糁样品捣碎，称取1 g至15 mL萃取瓶中，放入SPME装置，60℃下平衡15 min，采用上述萃取头于60℃顶空萃取30 min，随即插入GC-MS进样器中，每个样品进样3次。

1.2.3.2 气相色谱-质谱分析条件

气相色谱进样与程序升温条件:色谱柱(60 m×0.32 mm × 1.8 μm)，解吸 5.0 min(解析温度为260℃)，以不分流模式进样［8］。柱子初温 40 ℃，等温保持10 min，以5℃/min升温至200℃，然后以20℃/min升温至250℃，保持5 min，载气为氦气，流速1.0 mL/min。

质谱条件:电离方式为电子轰击(EI)源，电子能量70eV，电子倍增电压1 753 V;质量扫描范围30～550 amu;扫描速率1 scan/s。

定性、定量方法:通过计算机检索并根据Wiley710和NISTDEMO标准谱库进行数据对比，以匹配度＞800的才保留，确定化合物的名称［9］。挥发性化合物的相对百分含量按峰面积归一法进行计算［10］。

1.2.4 试验数据的统计分析

运用SPSS(18.0)软件对数据进行分析和处理。

2 结果与分析

2.1 传统豆糁的理化分析

以大豆原料为参照，对传统豆糁的主要理化指标进行了分析，测定结果见表1。

表1 传统豆糁和大豆原料的理化指标Table 1 Physical and chemical indicators of traditional Doushen and Soybean

传统豆糁的制作与当地的气候条件和制作工艺密切相关。从表1看出，豆糁产品的水分含量为31.36%～39.18%，产品的最终水分含量由水分活度(aw)决定。由于水分活度(aw)与环境的相对湿度等值，在豆糁发酵成熟过程中，使豆糁从表面蒸发与吸收的水分处于平衡状态。豆糁中的食盐含量(湿基)为7.39% ～9.83%，由于豆糁中食盐与水分形成的盐水浓度为15.87%～23.86%，食盐在水中离解，能够减少游离水分，降低游离水分含量，水分活度为0.79～0.82，从而抑制微生物的生长，达到防腐目的。

豆糁在发酵成熟过程中受环境微生物及温、湿度变化的影响，导致酶活性变化进而发生一系列生物化学反应，使蛋白质、脂肪、糖类等被微生物产生的酶降解，降解产物之间又发生复杂的化学反应［11］。从表1中明显看出，经过豆糁的加工、发酵与成熟过程，蛋白质含量显著降低，氨基态氮含量的增加(1.68～1.77g/100g DM)，说明在低水分活度环境下，虽然具有显著的抑菌防腐效果，但是，发酵过程的生物化学反应仍可进行，对于形成豆糁的良好风味品质具有重要意义。

2.2 传统豆糁自然发酵过程中理化变化

从发酵过程开始，每间隔5 d取1次样，分别测定豆糁自然发酵过程中总酸度、pH值、还原糖和氨基态氮的变化，结果如图1和图2所示。

由图1可以看出，发酵开始时pH为6.6左右，总酸度只有0.12 g/100 g(DM)，在发酵初期，总酸度快速升高，pH快速下降，到第10天后变化趋于平缓，15～20 d变化很小，到发酵的第25天时，pH和总酸度分别为5.31和4.57 g/100 g(DM)。发酵前期，豆糁中的微生物大量繁殖进而导致碳水化合物、脂肪等的分解，产生乳酸、乙酸等小分子有机酸，在降低蛋白含量的同时增加了游离氨基酸的含量，使得豆糁的总酸度增加和pH下降［12］。

图1 豆糁自然发酵过程中pH值和总酸度的变化Fig.1 Changes of pH and total acids during the natural fermentation of Doushen

由图2看出，还原糖含量在发酵前期(10 d)也急剧增加，达到19.81 g/100 g(DM)，主要是霉菌产生的淀粉酶和糖化酶将原料中的淀粉快速水解产生还原糖［13］，使得还原糖总量增加。随着发酵过程的进行，还原糖含量逐渐减少，主要是微生物的快速利用和消耗，一方面，还原糖为微生物的生长提供碳源，如乳酸菌发酵产生乳酸、乙酸、琥珀酸等小分子有机酸，另一方面，美拉德反应也消耗还原糖［14］。在发酵后期，还原糖含量下降趋于平缓，表明微生物代谢活动减弱，可能是由于aw、pH及总酸度的变化构成反馈抑制作用，抑制了微生物及酶的生化代谢活性。

氨基态氮的含量反映大豆蛋白在发酵过程中的水解程度，是发酵型豆制品的一项主要指标，其含量随着发酵过程的进行逐渐增加(图2)，前期增加较快，20 d后趋于平缓。这是由于发酵前期蛋白酶活力较高，有利于促进蛋白质的水解，从而氨基态氮含量增加较快，随着发酵过程的进行蛋白酶活力下降或受到抑制，氨基态氮的含量增速变缓［15］，但是随着后熟及贮藏过程的延续，蛋白质仍能发生缓慢的水解，氨基态氮的含量仍有积累。

图2 豆糁自然发酵过程中还原糖和氨基态氮的变化Fig.2 Changes of reducing sugar and amino-nitrogen during the natural fermentation of Doushen

2.3 传统豆糁挥发性化合物的分离鉴定

应用顶空固相微萃取法结合GC-MS对传统豆糁产品(样品1、样品2)中的挥发性化合物进行分离鉴定，每个样品进样3次，根据每个色谱峰的重现性，确定需要定性的挥发性化合物。然后，将其质谱信息与质谱数据库中标准化合物的质谱信息进行对比，以匹配度(＞800)确定化合物的名称，用归一化法比较挥发性化合物的相对含量。结果分别见图3和表2。

图3 传统豆糁挥发性化合物的总离子流色谱图Fig.3 Total ion current chromatograms of volatile compounds of the traditional Doushen

从表2看出，样品1和样品2共有75种挥发性化合物得到鉴定，其中烃类21种，醇类8种，醛类4种，酮类7种，酸类7种，酯类13种，其他类15种。在样品之间，挥发性化合物的种类及相对含量存在较大的变异性，可以反映出发酵过程的复杂性(表3)。

表2 传统豆糁中的挥发性化合物Table 2 Volatile components of the traditional Doushen

从表3看出，在2个样品中挥发性化合物的种类差异明显，样品1中其他类(杂环)化合物和酯类化合物种类较多，而样品2中则为烃类和其他类(杂环)化合物较多。2样品中仅有17种相同的挥发性化合物，分别为正十二烷、2，3-丁二醇、2，7-二甲基-4，5-辛二醇、1-辛烯-3-醇、1-癸醛、3-羟基-2-丁酮、异戊酸、环氧乙烷-2-羧酸乙酯、2，5-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪、2，3，5，6-四甲基吡嗪、2，3，5-三甲基-6-乙基吡嗪、2-甲氧基-4-乙烯苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、3-羟基-2-甲基-4-吡喃酮、4-烯丙基苯甲醚和对丙烯基茴香醚(茴香脑)。

表3 传统豆糁中的挥发性化合物的种类和相对含量Table 3 Types and contents of the volatile components of the traditional Doushen

从挥发性化合物的相对含量比较，2种样品之间也存在明显的差异。样品1中其他类(杂环)化合物含量最高(73.49%)，酯类次之(13.39%)，酸类第三(4.48%)。含量最高的挥发性化合物分别是:2，5-二甲 基 吡 嗪 (33.07%)、2，3，5，6-四 甲 基 吡 嗪(18.14%)、2，3，5-三甲基吡嗪(16.94%)、异丁酸丙酯(6.1%)、环氧乙烷-2-羧酸乙酯(5.81%)。而样品2中醇类化合物含量最高(31.59%)、酮类次之(23.79%)、其他类(杂环)第三(22.02%)。含量最高的挥发性化合物分别是:2，3-丁二醇(30.01%)、3-羟 基-2-丁 酮 (22.8%)、2，3，5，6-四 甲 基 吡 嗪(7.54%)、2，3，5-三甲基吡嗪(6.53%)。

根据前人研究［1-2］，大豆发酵调味品滋味和香味化合物的形成，除受原材料和热处理工艺的影响外，最重要的是豆曲培养或毛坯发酵时所形成的大量菌丝体在盐腌过程中借盐溶作用释放出多种水解酶系(如蛋白酶、肽酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶、低聚糖酶等)，将原料中的蛋白质、脂肪、碳水化合物等分解成肽、氨基酸、脂肪酸和糖类，从而构成了一个丰富的“风味物质前体库”，在后熟期间再经过一系列复杂的发酵代谢和生化反应，如酸发酵、醇发酵、酯化反应、氨基酸降解、美拉德反应等，从而形成了大量的风味化合物［16］。

醇类物质主要是由酵母菌发酵产生，一般阈值较高，含量低时对风味的贡献较小，在样品1中检测到5种，样品2中检测到6种，其中，2，3-丁二醇在样品2中相对含量最高(30.01%)，是检测到的主要醇类化合物。1-辛烯-3-醇在2种样品中均检测到，相对含量分别为0.36%和0.91%，由二十四碳四烯酸的氢过氧化物的降解产生，具有类似蘑菇的香气［17］。

醛类化合物主要来源于脂肪的氧化降解，一般阈值很低，具有较强的挥发性［17］，对发酵豆制品香味成分的贡献较大。本实验检测到的醛类有4种，苯乙醛只在样品2中检测到，相对含量为0.04%，具有类似风信子的香气，稀释后具有水果的甜香气。

酮类化合物大多是不饱和脂肪酸受热氧化和降解的产物，其阈值较低，产物伴有淡淡的花香和果香［18］，2样品中均检测到3-羟基-2-丁酮，相对含量分别为0.94%和23.79%，且相对含量差异明显。

酯类物质则是发酵豆制品香气的主体成分，赋予食品甜香、果香，其形成途径有2种，一是在发酵过程中由酵母酶催化生成，二是由有机酸和醇通过非酶催化的酯化反应生成。实验结果显示:样品1中酯类相对含量高于样品2，2样品中均检测到的酯类化合物为环氧乙烷-2-羧酸乙酯。

酚类物质虽然相对含量极微，只有0.52%和0.33%，但作为香气成分作用仍十分明显。

吡嗪类化合物主要是由蛋白质、氨基酸热分解、糖与蛋白质或氨基酸的美拉德反应所形成，是构成焙烤香味的主体物质［19］。吡嗪类物质在2样品中检测到的种类都相同，相对含量也都很高，分别为70.5%和15.97%。其形成过程可能与豆糁的自然晒露工艺有关，对豆糁的特征性风味起重要作用。

3 结论

在特定地域的气候条件下制备的传统豆糁，其水分含量为31.36% ～39.18%，水分活度为0.79～0.82，具有良好的抑菌防腐功效。在发酵过程中，总酸度、还原糖和氨基态氮含量的变化，说明仍有生物化学反应发生，并且发酵前期反应强度高于发酵后期，对豆糁风味品质的形成有重要贡献。

应用固相微萃取法，结合气相色谱-质谱联用仪，从2个豆糁样品中共鉴定出75种挥发性化合物，其中烃类21种，醇类8种，醛类4种，酮类7种，酸类7种，酯类13种，其他类15种。在样品之间，挥发性化合物的种类及相对含量存在较大的变异性。在2样品中仅鉴定出17种相同的挥发性化合物。具有代表性的风味化合物为:2，3-丁二醇、1-辛烯-3-醇、1-癸醛、3-羟基-2-丁酮、2，5-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪、2，3，5，6-四甲基吡嗪、3-羟基-2-甲基-4-吡喃酮等。

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