联合常规核型分析和FISH在儿童急性淋巴细胞白血病中的应用价值

陈万紫，黄慧芳，陈加弟，林晓岚，傅 蔷(福建医科大学附属协和医院福建省血液病研究所，福建省血液病学重点实验室，福州 350001;通讯作者，E-mail:huanghuif@126．com)

急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是最常见的儿童白血病类型。细胞遗传学特征是目前公认的具有独立预后价值的指标［1］，在形态学检查与免疫表型分析的基础上，检测患者遗传学异常对于指导儿童ALL危险度分层、判断预后及“量身定制”治疗方案具有重要作用。本研究采用间期荧光原位杂交((fluorescence in situ hybridization，FISH)技术，6组特异性 DNA探针检测189例儿童ALL骨髓标本的遗传学异常，并与常规染色体核型分析结果相比较，旨在探讨核型分析联合FISH技术检测儿童ALL遗传学异常的临床价值。

1 对象与方法

1．1 病例

189例ALL患儿2013－01～2014－12在福建医科大学附属协和医院血液科就诊住院，符合ALL的WHO标准［2］。其中男105例，女84例;年龄16－156个月，中位年龄为63个月。

1．2 R显带技术核型分析

采用直接法和短期培养法制备骨髓染色体标本，并采用常规R显带技术进行核型分析。染色体核型依《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN2013)》的规定进行描述。剩余细胞悬液保存于－20℃备用。

1．3 组合FISH检测

1．3．1 标记探针 探针选择 TEL/AML1，BCR/ABL，MLL，CSF4，CSP10 与 CSP17(北京金菩嘉医疗科技有限公司)。

1．3．2 FISH检测 将骨髓细胞悬液滴片，严格按照探针试剂盒提供的FISH操作说明书操作。

1．3．3 荧光显微镜检测及结果判断 用Olympus BX51荧光显微镜，油镜下通过 DAPI、FITC与RHOD滤光片计数300个细胞内荧光杂交信号，不计数重叠细胞。

1．4 统计分析

使用统计软件SPSS17．0进行统计分析，计数资料以率表示，率的比较采用χ2检验，以P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 常规染色体R显带核型分析结果

189例患儿骨髓标本中培养成功的有151例(79．89%)，检出异常核型 58 例(38．41%)，其中仅染色体结构异常者23例，仅数目异常的18例，同时合并染色体数目和结构异常17例。染色体结构异常涉及的染色体依次为9号(18/40)，14号(9/40)，6号(8/40)，8 号(7/40)，22 号(7/40)，19号(6/40)等。

本研究共检出高超二倍体(染色体数目＞50)19例(12．58%)，低超二倍体(染色体数目47－50)7 例(4．64%)，假二倍体 3 例(1．99%)，亚二倍体 7例(4．64%)。常见增多的染色体按检出率从大到小依次为 21号，10号，4号，17号，18，14号，8号，6号，22号，11号，12号及X染色体等。本研究检测到的染色体易位见表1。

表1 ALL儿童检测到的染色体易位分布Table 1 Incidence of various types of chromosome translocation in 189 children with ALL

2．2 FISH检测结果

189例标本均进行组合FISH检测，129例检测出异常(68．25%)，60 例未检出异常(31．75%)。在检出的异常中常见的有+17(92/129，71．13%)，+10(90/129，69．77%)，+4(56/129，43．14%)，AML1信号扩增(57/129，44．19%)，BCR 信号扩增(30/129，23．26%)，TEL/AML1 融合(39/129，30．23%)，MLL 断裂(21/129，16．28%)，ABL 信号扩增(17/129，13．18%)，TEL 信号扩增(18/129，13．95%)，BCR/ABL融合(10/129，7．75%)。38例骨髓标本未培养成功的患者中FISH检出异常的有23例(60．52%)，93例正常核型经FISH检测出异常的有67 例(72．04%)。

本研究中，39例(39/189，20．63%)FISH 检出TEL/AML1融合基因，10 例(10/189，5．29%)检出BCR/ABL融合基因，TEL/AML1检出率明显高于BCR/ABL(χ2=18．38，P ＜0．05)。

2．3 常规核型分析与FISH检测的方法学比较

表2结果显示，189例标本中有148例检出遗传学异常，单独FISH检出129例，而染色体核型分析仅检出58例。可见，FISH检测儿童ALL遗传学异常阳性率明显高于常规染色体核型分析(χ2=46．25，P ＜0．005)。

染色体核型正常的标本通过FISH检测出异常的67例(67/93，72．04%)，在染色体制备失败的38例标本中 FISH检出异常的有23例(23/38，60．53%)，两者无统计学差异(χ2=0．18，P ＞0．05)。

本研究中，有 19例(19/189，10．05%)标本FISH未检出异常，但通过常规核型分析检出了染色体数目和/或结构异常。

表2 染色体核型分析与FISH检出遗传学异常的比较 (例)Table 2 Comparison of chromosomal abnormalities detected by CCA and FISH (cases)

3 讨论

常规核型分析主要检测染色体数目和结构异常，对白血病的预后判断与指导临床治疗至关重要。细胞遗传学特征是目前公认的具有独立预后价值的指标［1］，但遗传学异常的检出率有较多的影响因素，本组资料显示联合常规核型分析和组合FISH检测可将儿童ALL的遗传学异常检出率提高至78．31%，与文献报道相近［3］。在常规核型分析方面，儿童 ALL染色体制备成功率不高，本研究为79．89%，略高于刘青等的报道［4］，但异常检出率(38．41%)低于文献报道［4－5］。本研究中 151 例骨髓培养成功的标本中高超二倍体占12．58%，低超二倍体占4．64%，亚二倍体占 4．64%，假二倍体占1．99%，与郭哗等［6］的报道相近。Sutcliffe 等［7］研究表明4、10或17号染色体三体提示预后较好，在本研究有129例标本FISH检测出不同程度的遗传学异常(68．25%)，且主要数目异常为 +17，+10，+4等。本组FISH检测出主要的融合基因为TEL/AML1(20．63%)，这与 Rubnitz 等［8］的研究相近。1994年Romana等［9］用FISH方法发现儿童ALL的隐匿性重现型易位t(12;21)。该易位产生的融合基因 TEL/AML1被证实是其发病的关键［10］，但t(12;21)用染色体核型分析检出率不足0．05%［11］。本研究R显带分析未能检出t(12;21)，这与其只能分析大于1条带即相对分子量＞104×103的异常，而且无法检出亚显微水平的染色缺失或重排有关［12］。儿童 ALL常见另一个融合基因是 BCR/ABL，研究表明Ph染色体对儿童ALL具有独立的预后价值［13］，在本组研究中，确定的有Ph染色体的患儿10 例(5．29%)，与文献报道相近［14］。

FISH技术能对间期和中期细胞进行分析，扩大了可检测的细胞群体，其采用原位杂交技术，定位至小片段基因，能分辨较小的染色体易位或缺失区域(相对分子质量50×103左右)等［15］，这在一定程度上弥补了核型分析的不足，提高了异常检出率。在本研究中染色体核型正常或染色体制备失败的141例标本中通过FISH检测出异常的有90例。显然，与核型分析相比，采用组合探针的FISH检测更为敏感。但是，在60例FISH未检出异常的标本中，有19例通过核型分析检测到染色体数目和/或结构异常;另外，在FISH和核型分析均检出一定程度遗传学异常的39例标本中，有31例的核型分析能在FISH检出染色体异常的基础上，检出了其他的染色体数目和/或结构异常。因此，R显带分析能更全面、详细地了解白血病细胞的遗传学信息，仍是白血病遗传学的研究基础。本研究189例儿童ALL患者通过R显带分析和FISH共检出细胞遗传学异常者148例(78．31%)，均显著高于单用FISH检测或单用核型分析的检出率;由此可见，组合FISH技术与R显带技术能显著提高儿童ALL染色体异常的检出率。

总之，常规染色体核型分析仍是检测儿童ALL的染色体数目和结构异常必不可少的手段，FISH则是其重要的补充，二者联合应用，可提高儿童ALL染色体异常检出率，获得更多、更精细、全面的儿童ALL的遗传学信息，提高遗传学检测在儿童ALL的预后评估以及追踪白血病微小残留等方面的作用。

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