Wnt信号通路中β-catenin、GSK3β及Lef-1在卵巢癌中的表达及其意义

郭玉霞，马利国，陈递林，李明娥，石丽云，叶芷芬，郑绘霞(暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院妇科，深圳 5800;山西医科大学第一医院病理科)

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，近几年来死亡率已位居女性生殖系统肿瘤的首位。卵巢癌的发病机制至今尚不明确，多数研究认为其可能与多种作用机制有关。近期研究发现，Wnt通路中信号成分的改变在卵巢癌的发生过程中起着重要作用。本研究主要检测Wnt信号转导通路中β-catenin、GSK3β及Lef-1在卵巢上皮性肿瘤中的表达及三指标在卵巢肿瘤中的相互作用关系，探讨Wnt信号通路在卵巢癌发病的作用机制，为卵巢癌的发生、发展、预后及治疗提供依据。

1 材料与方法

1．1 组织标本

收集暨南大学第二临床医学院(深圳市人民医院妇科)及山西医科大学第一医院病理科2003－02～2014－08正常卵巢上皮组织、卵巢良性肿瘤以及卵巢癌组织标本共218例，其中正常组织30例，卵巢浆液性囊腺瘤45例，黏液性囊腺瘤49例，浆液性囊腺癌51例，黏液性囊腺癌43例，年龄29－76岁，平均年龄53岁。所有标本经过两位经验丰富的高级职称病理专家诊断。

1．2 药物与试剂

兔抗人 β-catenin多克隆抗体(工作浓度1∶100)，鼠抗人 GSK3β 单克隆抗体(工作浓度1∶100)，鼠抗人 Lef-1单克隆抗体(工作浓度1∶100)和DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1．3 免疫组织化学

采用EnVision法检测β-catenin、GSK3β及Lef-1的表达。所有石蜡标本4 μm连续切片，DAB显色。卵巢癌组织染色设阳性对照和阴性对照，阴性对照采用PBS液代替一抗。

结果判定:β-catenin在细胞膜阳性，胞质或核中可出现阳性表达;GSK3β在细胞质呈棕黄色颗粒为阳性染色;Lef-1则以细胞核中出现棕黄色散在颗粒为阳性。高倍显微镜(400×)下随机观察5个视野，每个视野计数100个细胞，计算百分比，1分为阳性细胞1%－25%，2分为26%－50%，3分为51%－75%，4分为76%－100%。染色强度分为无(0分)，弱阳性(1分)，中等阳性(2分)，强阳性(3分)。二者相乘＞3分为阳性，≤3分为阴性。

1．4 统计学分析

采用SPSS 15．0软件进行统计学处理，数据比较行χ2检验，P＜0．05为有统计学意义。

2 结果

2．1 β-catenin在卵巢组织及卵巢肿瘤中的表达

β-catenin在腺癌中的表达(见图1)明显高于正常卵巢组织和卵巢良性腺瘤，差异有显著性意义(P＜0．05);β-catenin的表达与腺癌的类型无关(P＞0．05)，无论是浆液性还是黏液性腺癌，β-catenin表达只与淋巴结转移及FIGO分期有关(P＜0．05)，而与肿瘤分级无关(P ＞0．05，见表1，2)。

表1 β-catenin、GSK3β及Lef-1在组织中的表达情况Table 1 The expression of β-catenin，GSK3β and Lef-1 in different ovian tissues

表2 β-catenin、GSK3β及Lef-1在癌组织中与临床参数的比较Table 2 Relationship between expression of β-catenin，GSK3β and Lef-1 and clinicopathological parameters in cancer tissues

2．2 GSK3β在卵巢组织及卵巢肿瘤中的表达

GSK3β同样在腺癌中的表达(见图2)明显高于其他良性腺瘤及正常卵巢组织，差异统计学意义(P＜0．05);GSK3β表达与腺癌的类型无关(P＞0．05)，与肿瘤分级、淋巴结转移及FIGO分期有关(P ＜0．05，见表1，2)。

2．3 Lef-1在卵巢组织及卵巢肿瘤中的表达情况

Lef-1在腺癌中的表达(见图3)明显高于正常卵巢组织和卵巢良性腺瘤(P＜0．05);Lef-1中的表达与腺癌的类型无关(P＞0．05)，不论是浆液性还是黏液性腺癌，Lef-1表达只与淋巴结转移及FIGO分期有关(P ＜0．05)，与肿瘤分级无关(P ＞0．05，见表1，2)。

2．4 β-catenin与GSK3β及Lef-1在卵巢癌中的相关性比较

由表3可见，相关性分析显示，β-catenin与GSK3β 存在正相关(r=0．623，P=0．001)，与 Lef-1之间同样存在正相关(r=0．421，P=0．001)。

表3 β-catenin与GSK3β及Lef-1在卵巢癌中的相关性比较 (例)Table 3 Correlation between β-catenin，GSK3β and Lef-1 in human ovarian carcinoma (cases)

图1 β-catenin在浆液性及黏液性腺癌中的表达(EnVision，×100)Figure 1 Expression of β-catenin in serous and mucous adenocarcinoma(EnVision，×100)

3 讨论

图2 GSK3-β在浆液性腺癌及黏液性腺癌中的表达(EnVision，×100)Figure 2 Expression of GSK3-βin serous and mucous adenocarcinoma(EnVision，×100)

图3 Lef-1在浆液性及黏液性腺癌中的表达(EnVision，×100)Figure 3 Expression of Lef-1 in serous and mucous adenocarcinoma(EnVision，×100)

Wnt信号通路是一条较为复杂且保守的信号转导通路，在调控胚胎发育、参与细胞增殖分化及肿瘤的发生发展中都起着重要的作用［1］。研究发现Wnt信号通路中某些成分的改变在卵巢癌的发生过程中起着重要的作用。β-catenin是Wnt信号通路的核心分子，参与了多种基因的转录调控［2，3］。Wnt信号通路的异常激活是导致肿瘤发生发展的重要原因，而β-catenin在胞质内的大量积聚是Wnt信号通路被异常激活的关键因素，β-catenin的蓄积是肿瘤形成的重要原因。GSK3β是β-catenin的上游调节因子，可与APC和Axin形成复合体，从而使β-catenin发生磷酸化，最终β-catenin被降解，进入胞质及胞核，并参与转录过程，引发细胞周期的的失控，最后导致肿瘤细胞的增殖，从而促进肿瘤的进展［4－6］。

在肝细胞癌的研究中通过干扰及转染实验证实，Wnt/β-catenin信号通路可通过调节 GSK3β的表达来参与肝癌的发生发展［7］。在子宫内膜癌的研究中发现，β-catenin和GSK3β二者在癌组织中的表达明显高于正常子宫内膜组织，且与内膜癌的类型无关，而与组织学分级、临床分期、肌层浸润及淋巴结转移有关，二者表达之间有显著相关性，且二者过表达与子宫内膜癌的发生发展及转移有关［8］。

本研究表明，β-catenin及GSK3β蛋白在卵巢肿瘤中的表达明显高于正常卵巢组织，但在良性腺瘤中的表达低于腺癌中的表达，即正常组织、腺瘤组织、癌组织中表达顺序为逐渐增高，癌组织中最高，β-catenin和GSK3β蛋白三者间比较均有统计学差异。在癌组织中的比较发现，β-catenin及GSK3β蛋白表达与腺癌的类型无关，β-catenin与肿瘤分级无关，与淋巴结转移及FIGO分期有关，发生淋巴结转移及FIGO分期高者表达增高;GSK3β则与三者均有关，高级别、淋巴结有转移及FIGO分期高的病例GSK3β高表达。相关性分析显示，β-catenin与GSK3β之间存在正相关，表明 β-catenin和 GSK3β在卵巢癌的发生发展过程中起着一定的作用，且二者对肿瘤的发展存在正调节作用，二者的高表达可能是肿瘤恶性进展的标志。

Lef-1是淋巴增强因子家族成员，是 Wnt/βcatenin信号通路关键的核内转录因子，Lef-1在胚胎发育过程中起着重要的作用，其表达及功能异常是导致胚胎发育畸形的重要因素，Lef-1表达于多种组织细胞，其表达增高与恶性肿瘤有关［9，10］。但 βcatenin本身并不能与DNA结合，而是需要与DNA结合蛋白作用包括Lef-1的参与，在细胞核内共同完成调控靶基因的表达［11］，因此二者在肿瘤中的作用值得关注。

在宫颈癌细胞的研究中发现，LEF-1被成功转染并稳定表达β-catenin依赖的细胞株，细胞增殖能力及速度增强，凋亡水平降低，表明二者在宫颈癌的发生发展中起了重要的作用［12］。本研究结果显示，LEF-1在癌组织中的表达明显高于良性腺瘤及正常组织，且与腺癌的类型无关，只与淋巴结转移及FIGO分期有关，可见LEF-1在卵巢癌的发生发展过程中有一定的作用，并且可能是其恶性进展的标志。相关性分析显示，β-catenin与LEF-1表达之间存在正相关，表明二者能够持续Wnt信号通路，从而激活一系列靶基因引起细胞的持续增殖及恶性进展。

Wnt信号通路本身是一个复杂的基因网络，βcatenin在其中参与着重要的作用，我们的研究证实β-catenin、GSK3β及LEF-1在卵巢癌的发生发展过程中起着重要的作用，可能是其恶性进展的标志，是判断卵巢癌生物学行为的重要指标，但具体的作用机制还需要进一步研究。

［1］Sokol SY．Spatial and temporal aspects of Wnt signaling and planar cell polarity during vertebrate embryonic development［J］．Semin Cell Dev Biol，2015:Epub ahead of print．

［2］Badiglian Filho L，Oshima CT，De Oliveira Lima F，et al．Canonical and noncanonical Wnt pathway:a comparison among normal ovary，benign ovarian tumor and ovarian cancer［J］．Oncol Reports，2009，21(2):313－320．

［3］Bodnar L，Stanczak A，Cierniak S，et al．Wnt/β-catenin pathway as a potential prognostic and predictive marker in patients with advanced ovarian cancer［J］．J Ovarian Res，2014，7:16．

［4］李康，旦增．Wnt/β-catenin信号与胃癌防治研究进展［J］．南方医科大学学报，2014，34(12):1852－1856．

［5］Enzo MV，Rastrelli M，Rossi CR，et al．The Wnt/β-catenin pathway in human fibrotic-like diseases and its eligibility as a therapeutic target［J］．Mol Cell Ther，2015，3:1．

［6］Vanhollebeke B，Stone OA，Bostaille N，et al．Tip cell-specific requirement for an atypical Gpr124-and Reck-dependent Wnt/β-catenin pathway during brain angiogenesis［J］．Elife，2015，4:06489．

［7］王新红，孙逊，孟祥伟，等．Wnt/β－连环素信号通路对肝细胞癌信号分子的调节作用及其意义［J］．中华肝脏病杂志，2010，18(9):672－675．

［8］张智慧．P-GSK3β和β-catenin蛋白在子宫内膜癌中的表达及临床意义［J］．河北医药，2012，34(14):2091－2093．

［9］He L1，Lu N，Dai Q，et al．Wogonin induced G1 cell cycle arrest by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway and inactivating CDK8 in human colorectal cancer carcinoma cells［J］．Toxicology，2013，312:36－47．

［10］Jayaraj P，Sen S，Sharma A，et al．Eyelid sebaceous carcinoma:a novel mutation in lymphoid enhancer-binding factor 1(LEF1)［J］．Br J Dermatol，2015:Epub ahead of print．

［11］Behrens J，Lustjg B．The wnt connection to tumorigenesis［J］．Int J Dev Biol，2004，48(5－6):477－487．

［12］王淑红，南克俊，田涛，等．β-catenin依赖性LEF-1亚型对宫颈癌HeLa细胞生物行为学的影响［J］．西安交通大学学报:医学版，2010，31(3):313－317．