宫颈鳞癌EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表达与其临床特征及近期疗效的相关性研究

通信作者：王若峥，女，博士，教授，主任医师，博士生导师，研究方向：肿瘤放射治疗应用基础和临床应用，E-mail：wrz8526@163.com。

宫颈鳞癌EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表达与其临床特征及近期疗效的相关性研究

耿晓涛1， 马栋辉1， 古丽娜·库尔班1， 王若峥1,2

(新疆医科大学1附属肿瘤医院放疗中心,2新疆肿瘤学重点实验室， 乌鲁木齐830011)

摘要：目的探讨宫颈鳞癌(cervical squamous cell carcinomas,CSCC)组织中表皮生长因子受体(EGFR)、Rab5a、Rab21蛋白表达及其与临床特征及近期疗效的关系，评估EGFR、Rab5a、Rab21蛋白在CSCC进展、转移及近期疗效中的价值。方法收集60例CSCC组织标本，采用免疫组织化学法检测EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表达情况。采用卡方或确切概率法、非参数Spearman等级相关、多因素Logistic回归分析法分析其与临床特征及近期疗效的相关性。结果EGFR、Rab5a、Rab21蛋白阳性表达率分别为70.0%、73.3%、55.0%，EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表达均与肿瘤分化程度、淋巴结转移有关(P<0.05)，EGFR蛋白表达与临床分期有关(P=0.005)，Rab21蛋白表达与肿瘤直径有关(P=0.044)；Spearman等级相关分析显示：EGFR与Rab5a蛋白表达水平呈正相关(r=0.428，P=0.001)，EGFR与Rab21蛋白表达水平呈负相关(r=-0.300，P=0.020)；EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表达均不是影响近期疗效的独立因素(P>0.05)，EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表达对客观有效率RR无明显影响(P>0.05)。结论EGFR蛋白表达可能为CSCC高危进展的参考指标；Rab5a在EGFR介导的信号传导通路中可能发挥正性调节作用；Rab21在EGFR介导的信号传导通路中可能发挥负性调节作用。

关键词：宫颈肿瘤； 鳞状细胞； 表皮生长因子； Rab5a； Rab21

基金项目：科技部国际合作项目(2012DFA31560)

作者简介：耿晓涛(1989-)，男，在读硕士，研究方向：肿瘤放射治疗临床应用研究。

中图分类号：R737.33

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.03.025

[收稿日期：2014-10-21]

The association studies of EGFR, Rab5a, Rab21 expression with clinical

characteristics and short-term efficacy in cervical squamous cell carcinoma

GENG Xiaotao1， MA Donghui1， Gulina Kuerban1， WANG Ruozheng1,2

(1DepartmentofRadiationOncology,TheAffiliatedTumorHospital,2KeyLaboratoryofOncology,

XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between EGFR, Rab5a, Rab21 protein expression and clinical features and the short-term efficacy in cervical squamous cell carcinoma. MethodsImmunohistochemistry method was used to detect EGFR, Rab5a, Rab21 protein expression levels in 60 cases of CSCC. Chi-Square, Spearman rank correlation, Logistic regression analysis method were used. ResultsThe protein expression rates of EGFR, Rab5a, Rab21 were 70.0%, 73.3%, 55.0%, EGFR, Rab5a, Rab21 protein expression were correlated with lymph node metastasis and tumor differentiation (P<0.05); EGFR protein expression was correlated with clinical stage (P=0.005); Rab21 protein expression was correlated with the diameter of tumor (P=0.044); Spearman rank correlation analysis showed that EGFR was positively correlated with Rab5a (r=0.428, P=0.001) and EGFR was negatively correlated with Rab21 expression (r=-0.300, P=0.020). EGFR, Rab5a and Rab21 protein expression were not the independent factors of the short-term efficacy in CSCC (P>0.05); EGFR, Rab5a and Rab21 protein expression had no significant effect on objective efficiency (P>0.05). ConclusionEGFR protein expression may be the reference index of progression of CSCC; Rab5a may play a positive role in the regulation of EGFR-mediated signal transduction pathway while Rab21 may play a negative role.

Key words: cervical neoplasms; Neoplasms，squamous cell；Receptor; epidermal growth factor; Rab5a; Rab21; short-term efficacy

据WHO报道，中国宫颈癌发病率居世界第二位，死亡率居首位，且呈现年轻化趋势，严重威胁女性健康。在宫颈癌中，鳞癌是主要的病理类型，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor， EGFR)及其信号通路参与了宫颈癌的发生及进展，参与EGFR信号通路的多种蛋白已经被证实与宫颈癌的发生和预后相关[1]。Rab蛋白家族是EGFR信号通路的重要组成部分，其成员Rab5a和Rab21蛋白在参与肿瘤细胞浸润及转移的同时能影响EGFR介导的MAPK信号通路。目前，宫颈鳞癌(CSCC)中Rab5a和Rab21蛋白表达对EGFR及其介导的信号传导通路关系仍不清楚。本实验通过探讨CSCC中EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表达与其临床特征及近期疗效的关系，分析Rab5a、Rab21蛋白在EGFR介导的MAPK信号通路中的作用，评估EGFR、Rab5a、Rab21蛋白对CSCC进展、转移及近期疗效的价值。

1资料与方法

1.1一般资料选取2012年9月-2013年9月新疆医科大学附属肿瘤医院60例CSCC患者的组织标本，无近期妊娠史及肿瘤病史，年龄30～70岁，KPS≥60分。按照国际妇产科协会(FIGO)2009年宫颈癌分期：Ⅱ期27例，Ⅲ期31例，Ⅳ期2例；肿瘤分化程度：高分化3例，中分化34例，低分化23例。根据国内外年龄分组标准[4]：年轻宫颈癌(≤35岁)组与中老年宫颈癌组(>35岁)。根据国内外参考标准[5-6]，肿瘤直径大小以4 cm为界分两组。全组患者均有完整的临床及病理学资料。

1.2治疗方法依据国家卫生部妇科肿瘤诊治规范，中晚期宫颈癌治疗行放疗为主结合铂类为主化疗的综合治疗。放疗方案：(1)体外盆腔大野放疗：放射野耻骨联合下缘以下4 cm为下缘，腰5椎体上缘为上界，股骨头中线向外旁开1.0 cm为两侧缘，前后野对应。放疗剂量前后野轮流能量6MV-X线照射，源皮距SSD为100 cm，总剂量为3 000 cGy。(2)体外盆腔四野放疗：放射野及剂量：在盆腔大野的基础上中心4 cm挡铅，保护直肠及膀胱，总剂量为2 500 cGy。(3)三维高剂量率腔内后装治疗：拟行6～7次，A点共计3 600～4 200 cGy。照射范围：宫颈、子宫、阴道上段、宫旁三角。化疗方案(体外盆腔大野放疗2 000 cGy左右开始化疗，共行3～6个疗程)：PVB(顺铂50 mg/m2+盐酸博莱霉素30 mg+硫酸长春新碱1.5 mg/m2)或TP(紫杉醇135 mg/m2+顺铂50 mg/m2)。

1.3疗效评价标准患者治疗结束后3个月，行妇检、影像学(B超或骨盆MRI/CT)及肿瘤相关抗原等检查。根据美国ASCO会议上提出的实体瘤疗效评价标(RECIST)：完全缓解(CR)：可见肿瘤病灶完全消失，无新病灶出现，至少维持4 w；部分缓解(PR)：肿瘤病灶最大径之和减小30%以上，至少维持4 w；疾病稳定(SD)：肿瘤病灶最大径之和缩小不足30%或增大未超过20%，无新病灶出现；病变进展(PD)：肿瘤病灶最大径之和至少增加≥20%或有新病灶出现。客观有效率RR(缓解率)=(CR+PR)/(CR+PR+SD+PD)。

1.4主要试剂及检测方法一抗(鼠抗人EGFR单克隆抗体、兔抗人Rab5a多克隆抗体、鼠抗人Rab21多克隆抗体)购自美国Santa Cruz公司；二抗(PV-6000试剂盒)购自北京中杉金桥科技有限公司。每个蜡块连续4 μm厚切片5张，分别用于HE、免疫组化染色及预实验，用己知阳性切片做阳性对照，PBS代替一抗做阴性对照。

1.5结果判定标准以胞浆和(或)胞膜出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。阴性(-)：阳性细胞数≤10%，阳性：阳性细胞数>10%，其中11%～25%为(+)，26%～50%为(++)，51%～75%为(+++)，76%～100%为(++++)。

1.6统计学处理采用SPSS17.0软件进行统计学分析，计数资料用百分比表示，组间差异由卡方或四格表确切概率法检验，两者相关性由非参数Spearman等级相关法检验，近期疗效的多因素分析应用Logistic回归分析法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1CSCC组织中EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表达EGFR蛋白阳性定位于胞浆及胞膜(图1)，Rab5a蛋白阳性定位于胞浆及胞膜(图2)，Rab21蛋白阳性定位于胞浆及胞膜(图3)。60例患者中，EGFR蛋白阳性表达率为70.0%(42/60)，Rab5a蛋白阳性表达率为73.3%(44/60)，Rab21蛋白阳性表达率为55.0%(33/60)，见表1。

表1　CSCC组织中EGFR、Rab5a和Rab21蛋白表达率/例(%)

2.2CSCC组织中EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表达关系EGFR蛋白阳性表达组中，Rab5a、Rab21蛋白阳性表达率分别为85.7%、45.2%，EGFR蛋白阴性表达组中分别为44.4%、77.8%，差异均有统计学意义(P=0.001、0.020)(表2)。Spearman相关分析显示:CSCC组织中EGFR与Rab5a蛋白表达呈正相关(r=0.428，P=0.001)，EGFR与Rab21蛋白表达呈负相关(r=-0.300，P=0.020)(表2)。

表2　CSCC组织中EGFR蛋白表达与Rab5a、Rab21蛋白

2.3CSCC组织中EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表达与临床特征的关系EGFR蛋白表达与临床分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移有关(P=0.005、0.006、0.000)，与年龄、民族、HPV感染、肿瘤直径无关(P>0.05)；Rab5a蛋白表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移有关(P=0.002、0.000)，与年龄、民族、HPV感染、临床分期、肿瘤直径无关(P>0.05)；Rab21蛋白表达与肿瘤分化程度、肿瘤直径、淋巴结转移有关(P=0.001、0.044、0.027)，与年龄、民族、HPV感染、临床分期无关(P>0.05)(表3)。

表3　EGFR、Rab5a、Rab21表达与CSCC患者临床特征的关系/例(%)

2.4CSCC组织中EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表达及临床特征对客观有效率的关系分析60例患者中6例失访，随访率为90%。患者CR47例，PR2例，SD3例、PD2例，客观有效率为90.7%，维吾尔族和汉族患者RR分别为91.7%(33/36)、88.9%(16/18)，差异无统计学意义(P>0.05)；肿瘤直径<4 cm组客观有效率RR为100%(30/30)，≥4 cm组为79.2%(19/24)，差异有统计学意义(χ2=4.631，P=0.031)；EGFR阳性、阴性组RR分别为91.9%、88.2%，Rab5a阳性、阴性组分别为92.1%、87.5%，Rab21阳性、阴性组为93.3%、87.5%，差异均无统计学意义(P>0.05)；低分化组客观有效率(100%)较中-高分化组(83.9%)明显增高，但差异无统计学意义(P=0.122)，Spearman相关分析显示：客观有效率RR与肿瘤分化程度呈正相关(r=0.275，P=0.044)，RR与年龄、HPV感染、临床分期、淋巴结转移、治疗方法无相关性(P>0.05)(表4)。

2.5近期疗效分析将EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表达、肿瘤直径及肿瘤分化程度纳入logistic多因素回归分析。结果显示：在CSCC中，肿瘤直径、肿瘤分化程度及EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表达均不是影响近期疗效的独立因素(表5)。

3讨论

表皮生长因子受体(EGFR)是继高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)之后，与宫颈癌的发生发展密切相关的重要因素之一[11]，也是目前恶性肿瘤靶向药物治疗研究最多的靶点之一，因此研究其介导的信号传导通路中的正、负调控机制意义重大。目前研究EGFR信号传导通路中最广泛的通路之一为ras/raf/MEK/MAPK信号传导通路，配体与EGFR受体结合后激活受体，通过内吞上调、下调该信号传导通路。Rab家族是Ras超家族中的一个最大亚家族,其蛋白为小GTP结合蛋白。Rab蛋白与肿瘤的发生发展密切相关，且部分Rab蛋白可以通过EGFR的内吞来调控其介导的MAPK信号通路[12]。Rab5和Rab21是Rab蛋白家族中2个重要的成员，研究表明，Rab5和Rab21均与α-整合素相关，并且可以调节EGFR的内吞作用，从而影响信号通路的传导[13-15]。EGFR蛋白表达及Rab对其信号传导通路与临床关联性研究鲜见报道。本研究通过检测宫颈癌中EGFR和Rab5a、Rab21蛋白表达，探讨Rab5a、Rab21及EGFR与宫颈鳞癌临床特征和近期疗效的关系。

表4　单因素分析影响总体客观有效率RR的因素

表5　宫颈鳞癌患者3个月近期疗效的多因素分析结果

EGFR过表达是宫颈鳞癌的重要生物学特征。Li等[7]研究显示在CSCC中EGFR阳性表达率为79.17%(19/24)，周素英等[8]研究显示在CSCC中EGFR阳性表达率是78.26%(54/69)。Iida等[9]研究显示，CSCC中EGFR蛋白过表达(++/+++)率为37%(22/59)。本研究显示，EGFR蛋白阳性表达率为70.0%(42/60)，EGFR蛋白过表达(++/+++)率为55%(33/60)，与以上报道结果接近。关于EGFR表达与HPV感染关系无关的报道居多[10-11]，本研究也显示HPV感染与EGFR无关。

A: EGFR表达(-)

B: EGFR表达(+)

C: EGFR表达(++)

D: EGFR表达(+++)

图1EGFR蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达(阳性颗粒位于胞膜和胞浆)(SP染色×100)

A: Rab5a表达(-)

B: Rab5a表达(+)

C: Rab5a表达(++)

D: Rab5a表达(+++)

图2Rab5a蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达(阳性颗粒位于胞膜和胞浆)(SP染色×100)

A: Rab21表达(-)

B: Rab21表达(+)

C: Rab5a表达(++)

D: Rab21表达(+++)

图3Rab21蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达(阳性颗粒位于胞膜和胞浆)(SP染色×100)

周素英等[8]报道，EGFR蛋白表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及淋巴脉管间隙浸润相关(P<0.05)。王亚萍等[16]报道EGFR蛋白表达与宫颈鳞癌淋巴结转移有关(P=0.01)。Scambia等[17]研究表明EGFR蛋白表达与宫颈癌临床分期有关(P<0.05)。Pérez-Regadera等[18]研究指出EGFR过表达与年龄无关(P>0.05)。本研究CSCC中EGFR蛋白表达与临床分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移有关(P=0.006、0.005、0.000)，与年龄无关(P=0.875)，这与以上文献研究结果相似。

已有研究报道，Rab5a、Rab21蛋白在调节早期内吞体通路中起到作用，但对MAPK信号传导通路的调控作用却不尽相同[14，19-20]。Liu 等[20]对CSCC组织及HeLa细胞株的研究显示Rab5a存在高表达，能促进癌细胞的能动扩散性和侵袭性，且上调MAPK信号传导通路。Yang等[14]研究验证Rab21能够促进宫颈癌HeLa细胞表面的EGFR内吞，与EGFR共定位，通过促进其降解，抑制EGFR介导的MAPK信号通路。本研究显示EGFR与Rab5a蛋白表达呈正相关(r=0.428，P=0.001)，与Rab21蛋白表达呈负相关(r=-0.300，P=0.020)，提示CSCC中Rab5a蛋白在MAPK信号传导通路中可能发挥正性调节作用，Rab21蛋白在MAPK信号传导通路中可能发挥负性调节作用，与文献[14,20]研究结果相符。Rab5a、Rab21蛋白与CSCC临床特征相关性研究未见报道。Sheng等[21]研究报道Rab5a与肝癌细胞增殖及转移有关。本研究中CSCC中Rab5a蛋白表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移有关(P=0.002、0.000)；Rab21蛋白表达与肿瘤分化程度、肿瘤直径、淋巴结转移有关(P=0.001、0.044、0.027)，与年龄、民族、HPV感染、临床分期无关(P>0.05)，提示Rab5a、Rab21蛋白表达可能与CSCC的转移、预后有关。

综上所述，EGFR蛋白表达可能是CSCC高危进展的参考指标；Rab5a在EGFR介导的信号传导通路中可能发挥正性调节作用；Rab21在EGFR介导的信号传导通路中可能发挥负性调节作用；联合检测EGFR、Rab5a、Rab21可能为CSCC诊断、转移及个体化疗法提供理论依据。

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(本文编辑周芳)