姜黄素对结肠癌细胞HT-29中NDRG2基因表达的影响

姜黄素对结肠癌细胞HT-29中NDRG2基因表达的影响

李照伟柳长明1何其勇1赵东慧2姜吉洵2

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154002)

摘要〔〕目的探讨姜黄素对HT-29结肠癌细胞株中N-myc F下游调节基因(NDRG)2表达的影响及姜黄素不同浓度处理下NDRG2基因表达情况。方法应用不同浓度的姜黄素干预体外培养的HT-29细胞48 h后，提取总RNA，并运用RT-PCR技术检测姜黄素对HT-29细胞中NDRG2基因表达的影响。利用RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，运用Western印迹技术，检测姜黄素对HT-29细胞中NDRG2蛋白质表达的影响。结果姜黄素不但能够在mRNA水平促进HT-29细胞中NDRG2基因的表达，且能够促进NDRG2蛋白质的表达，且均具有统计学意义。但有效浓度范围在20～100 μmol/L，且80 μmol/L效果最佳，表明姜黄素在一定浓度范围内对NDRG2基因上调 (P<0.05)，RG2基因，并能有效抑制肿瘤细胞。结论姜黄素能够促进结肠癌细胞株HT-29细胞中NDRG2基因和蛋白的表达，且具有剂量依赖性，最佳浓度为80 μmol/L。

关键词〔〕结肠癌；HT-29；NDRG2基因；姜黄素

中图分类号〔〕R73〔

通讯作者：柳长明(1969-)，男，博士，副主任医师，主要从事肠道肿瘤研究。

1佳木斯大学附属第一医院2佳木斯市中心医院

第一作者：李照伟(1982-)，男，硕士，主要从事肠道肿瘤研究。

N-myc下游调节基因(NDRG)家族是近年来发现的一个新基因家族，主要是由NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4组成〔1〕。前期的研究发现NDRG2的表达量与细胞的分化呈正相关，和增殖能力呈负相关〔2〕。姜黄素是从姜科、天南星科中一些植物的根茎中提取的一种化学成分，可以增强抗肿瘤药物塞来昔布的药效〔3〕。本研究主要探讨不同浓度梯度姜黄素的干预下结肠癌组织中NDRG2基因的表达。

1材料与方法

1.1材料选用人结肠癌细胞株(HT-29)作为体外模型，由中国科学院上海细胞库提供；姜黄素粉剂购自成都普非德生物有限公司。

1.2主要仪器微量注射器(10～1 000 μl)EPPENdORF公司产品;图像采集显微镜，BX50，日本OLYMPUS公司；Mini垂直电泳仪，Bio-Rad，昆士兰生物(Queensland)公司：PCR仪RR014A，日本TAKARA公司。

1.3HT-29细胞的复苏、培养、传代、种板姜黄素溶解于二甲基亚砜配制成的100 mmol/L的储存液，配置终浓度分别为20、40、80、100 μmol/L，滴入6孔培养板中,37℃细胞培养箱中进行培养。

1.4RT-PCR应用不同浓度的姜黄素干预体外培养的HT-29细胞48 h后，提取总RNA,引物设计、反转录得到cDNA做模板，再行RT-PCR检测NDRG2 mRNA表达水平。

1.5Western印迹利用RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶分离蛋白，再通过电湿转法将分离的蛋白转至聚氟偏乙烯(PVDF)膜，利用NDRG2蛋白抗体检测姜黄素对HT-29细胞中NDRG2蛋白质表达的影响。

1.6统计学方法采用SPSS19.0 软件，计数资料组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法。

2结果

2.1姜黄素促进HT-29细胞中NDRG2基因mRNA表达姜黄素对HT-29细胞中NDRG2基因表达有促进作用，且NDRG2 mRNA表达量的增加与姜黄素浓度呈剂量依赖性关系，NDRG2 mRNA表达量随姜黄素浓度的增加而上调；且80 μmol/L浓度时，NDRG2增加量最明显；当姜黄素浓度继续增加时，对NDRG2 mRNA的表达促进作用反而有所减弱。60、80 μmol/L姜黄素组与 0、20 μmol/L姜黄素处理组相比，NDRG2基因的表达显著增加(P<0.01)，但当姜黄素浓度增加到100 μmol/L时， NDRG2 mRNA的表达并没有随浓度增加而继续增加，反而有所下降，但与阴性对照组相比仍差异显著(P<0.05)。见图1。

与0 μmol/L组比较：1)P<0.05，2)P<0.01，下图同 图1　姜黄素处理48 h后NDGR2 mRNA表达水平变化

图2　姜黄素处理48 h后HT-29结肠癌细胞中 NDGR2蛋白质表达的变化

2.2姜黄素促进HT-29细胞中NDRG2蛋白质的表达图2可见，DRG2蛋白表达量随姜黄素浓度的增加而上调，且当姜黄素浓度为60或80 μmol/L时，NDRG2蛋白表达量增加最明显，当姜黄素浓度继续增加时，对NDRG2蛋白表达的促进作用反而有所减弱(图2A)。当用20、40 μmol/L姜黄素处理细胞时，与阴性对照组相比，NDRG2蛋白的增加较显著；而用60、80 μmol/L姜黄素处理HT-29细胞时， 与阴性对照组相比，NDRG2蛋白的表达增加更明显(P<0.01)，但当姜黄素浓度增加到100 μmol/L时， NDRG2蛋白表达量并没有随浓度增加而继续增加，反而有所下降，但与阴性对照组相比差异仍比较显著(P<0.05)。

3讨论

癌基因的激活与抑癌基因的失活参与癌的发生、发展，针对其二者的治疗也越来越多。 在目前所有的肿瘤基因治疗计划中,免疫基因治疗占40%。也有用药物敏感基因即自杀基因治疗,还有肿瘤抑制基因治疗,以及用多药耐药基因转染到患者造血干细胞以增强患者对化疗的耐受性等〔4〕。有人在结肠癌细胞株中导入抗癌基因,其生长就受到不同程度的抑制,如果SW480细胞株缺失或突变的是P53基因,导入野生型P53即发现肿瘤明显消退〔5〕。

相关文献报道〔6〕，通过原位杂交和免疫组化方法证实,姜黄素处理细胞后,c-myc基因 mRNA 和蛋白表达水平均降低,说明 c-myc 基因表达水平降低与姜黄素诱导细胞的凋亡密切相关，其具体机制可能与Caspase-3 的表达增加引起细胞内的凋亡有重大关系。同时，相关研究人员利用反义表达载体封闭内源性的c-myc表达后发现NDRG2的启动子活性反而略有增加，这可能与myc的过表达可以抑制NDRG2启动子有关。

本研究结果表明，姜黄素在一定浓度范围内使NDRG2基因上调，其有效浓度为40～100 μmol/L，能有效抑制肿瘤细胞。

4参考文献

1Stanton BR, Perkins AS, Tessarollo L,etal. Loss of N-myc function results in embryonic lethality and failure of the epithelial component of the embryo to develop〔J〕.Genes Dev,1992;6(12A): 2235-47.

2李剑，林树新，刘新平，等.一种新的抑癌候选基因：-DNR2在人类正常组织及相应肿瘤中的表达〔J〕.生物化学与生物物理进展,2002;29(2): 223-7.

3国家药典委员会.中国药典临床用药须知〔M〕.北京：人民卫生出版社，2005:201.

4沃兴德,洪行球,魏佳萍,等.姜黄醇提取物对高脂血症患者脂代谢及肝肾功能的影响〔J〕.浙江中医学院学报,1999;23(1):20-2.

5Charron J,Malynn BA,Fisher P,etal. Embryonic lethality in mice homozygous for a targeted disruption of the N-myc gene〔J〕.Genes Dev，1992;6(12A): 2248-57.

6Shimono A,Okuda T, Kondoh H.N-myc-dependent repression of ndr1, a gene identified by direct subtraction of whole mouse embryo cDNAs between wild type and N-myc mutant〔J〕.Mech Dev,1999;83(1-2): 39-52.

〔2013-09-12修回〕

(编辑袁左鸣)