DiaionHP–20大孔吸附树脂分离纯化含羞草种子中的黄酮类物质*

叶伶菊，郭莎，张丽冰，任孟伟，闫正

(河北大学化学与环境科学学院，河北保定 071002)

含羞草是豆科类植物，豆科含羞草属植物含羞草Mimosa pudica L.的全草［1］，别名知羞草、怕羞草、望江南等。含羞草主要分布在华东、华南、东南等地，具有清热利湿、安神镇静、止痛消肿之功效。黄酮类物质是含羞草中的主要活性物质之一，且其具有显著的生理活性，近年来研究表明，黄酮类物质具有维持血管正常渗透压，降低血管脆性，降低人体胆固醇含量，抗过敏，降血压，抑制癌变和抗病毒等作用［2］，因此分离纯化含羞草中的黄酮类物质具有重要意义。目前关于含羞草黄酮类物质的提取工艺已有研究［3］，但是大孔吸附树脂分离纯化含羞草中黄酮类物质鲜有研究。

大孔吸附树脂是近年来发展起来的新型分离技术，具有价廉、吸附容量大、可反复使用等优点，因此被广泛应用于中药有效成分分离纯化和天然药物化学成分提取分离［4–8］。笔者对Diaion HP–20大孔吸附树脂分离纯化含羞草中的黄酮类物质进行研究，优化确定最佳工艺条件，为分离纯化含羞草中的黄酮类物质提供实验依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

紫外可见分光光度计：4802型，上海尤尼柯仪器有限公司；

架盘药物天平：精度0.1 g，上海精科分析仪器厂；

恒温水浴锅：B–220型，上海亚荣分析仪器厂；

旋转蒸发仪：RE–52型，上海亚荣分析仪器厂；

微型高速万能试样粉粹机：FW80型，北京中兴伟业仪器有限公司；

自动双重纯水蒸馏器：SZ–93型，上海亚荣生化仪器厂；

移液枪：1 000～5 000 μL，北京大龙兴创仪器厂；

NaNO2，Al(NO3)3，NaOH，无水乙醇：分析纯，天津华东试剂厂；

大孔吸附树脂：Diaion HP–20，日本三菱化学公司；

芦丁标准品：分析纯，中国药品生物制品鉴定所；

含羞草种子样品：采于海南三亚。

1.2 实验方法

取预处理好的树脂2.0 g，吸干表面水分后放入100 mL具塞磨口锥形瓶中，加入40 mL含羞草提取液，置于25℃恒温水浴锅中静置吸附24 h，过滤，取滤液，测定滤液中黄酮物质的含量，按下式计算室温下大孔吸附树脂的静态吸附容量：

1.2.1 Diaion HP–20大孔吸附树脂的预处理

取适量Diaion HP–20大孔吸附树脂用2.5BV(表示2.5倍柱体积)无水乙醇浸泡24 h，倾倒去上层无水乙醇，将树脂湿法装入玻璃柱中，再用95%乙醇洗脱至流出液加去离子水不出现浑浊，并用去离子水冲洗树脂层至流出液无乙醇味为止。

1.2.2 样品预处理

将适量样品放入粉碎机中，在10 000 r／min转速下粉碎3 min，然后将粉碎的样品过0.250 mm筛，将过完筛的样品置于试样瓶中备用。

1.2.3 标准曲线绘制

准确称取烘干至恒重的芦丁标准品100 mg，加入70 mL甲醇微热溶解，冷却至室温后，转入100 mL容量瓶中，用甲醇定容。然后精密移取15.00 mL于另一100 mL容量瓶中，稀释定容，即得1 mg／mL的芦丁标准品溶液。

精密移取上述芦丁标准品溶液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL于10 mL容量瓶中，各加30%乙醇至5 mL，加5%亚硝酸钠0.3 mL充分摇匀，放置5 min；再各加入10%硝酸铝0.3 mL充分摇匀，放置6 min；然后加入1.0 mol／L氢氧化钠4 mL，用去离子水定容至标线，放置20 min后于510 nm处测量吸光度(以试剂空白为参比)，重复测量3次，取平均值，以芦丁质量浓度c(mg／mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。线性回归方程：A=10.152 38c+0.001 29，r=0.999 3。

1.2.4 含羞草中黄酮类物质的提取工艺

采用超声提取法，取处理好的含羞草种子样品适量，根据正交实验L9(3,4)筛选出最优提取工艺，即60%乙醇溶液，含羞草种子质量(g)与60%乙醇溶液体积(mL)比为1∶8，超声温度40～44℃，超声时间50 min，制得含羞草黄酮提取液，备用。

1.2.5 黄酮类物质含量测定

含羞草中黄酮类物质的含量测定采用NaNO2–Al(NO3)3比色法，按照芦丁标准曲线黄酮含量的测定方法，在510 nm处测量吸光度，标准曲线法定量。

2 结果与讨论

2.1 大孔吸附树脂吸附容量的测定

式中：Q——静态吸附容量，mg／g；

co——提取液中初始的总黄酮质量浓度， mg／mL；

c1——吸附24 h后溶液中剩余的总黄酮质量浓度，mg／mL；

V1——提取液的体积，mL；

m——树脂质量，g。

利用标准曲线测定黄酮类物质的含量，含羞草提取液中黄酮类物质的初始质量浓度为0.145 mg／mL，恒温水浴24 h后，测定平衡吸附液中剩余黄酮类物质的含量，根据(1)式计算得出大孔吸附树脂的吸附容量为2 mg／g。

2.2 大孔吸附树脂解吸率的测定

将预处理好的大孔吸附树脂置于100 mL的具塞磨口锥形瓶中，加入40%的乙醇溶液50 mL，于25℃的恒温水浴锅中解吸24 h，过滤，取滤液，测滤液中总黄酮的浓度，按下式计算在室温下大孔吸附树脂的解吸率：

式中：D——大孔吸附树脂的解吸率，%；

c2——解吸24 h后解吸溶液中的总黄酮质量浓度，mg／mL；

V2——解吸液体积，mL。

根据式(2)计算得出40%乙醇溶液对大孔吸附树脂的解吸率是85%。

2.3 上样速度对大孔吸附树脂吸附量的影响

将2.0 g预处理好的树脂装入玻璃层析柱中，再将10 mL含羞草黄酮提取液分别以1，2，3，4，5 mL／min的速度上样，上样后分别检测各管中黄酮的浓度，计算不同上样速度下的吸附容量，比较选择出最佳的上样速度。

上样速度对大孔吸附树脂吸附黄酮类物质有一定影响，结果见图1。

图1 上样速度对大孔树脂吸附容量的影响

由图1可知，随着上样速度的增加吸附量先增加后减小，当上样速度为3 mL／min时，大孔吸附树脂对黄酮的吸附效果最好，所以确定最佳上样速度为3 mL／min。

2.4 洗脱液浓度对大孔吸附树脂解吸率的影响

大孔吸附树脂分离纯化植物提取液中的有效成分时常选用乙醇水溶液作为洗脱剂，原因是其毒性小，价格低，吸附效果较好。将2.0 g预处理好的树脂装入玻璃层析柱中，加入10 mL含羞草提取液，以3 mL／min上样速度上样，依次用体积分数为20%，40%，60%，80%，100%的乙醇溶液以3 mL／min进行洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中黄酮类物质的含量，探讨不同体积分数乙醇水溶液对大孔吸附树脂解吸率的影响。

不同体积分数的乙醇溶液对大孔吸附树脂解吸率的影响实验结果如图2所示。

图2 乙醇溶液的体积分数对大孔吸附树脂解吸率的影响

由图2可知，乙醇溶液体积分数为40%时对树脂的解吸附效果最好，所以选择体积分数为40%的乙醇溶液为洗脱液。

2.5 洗脱速率对大孔吸附树脂解吸率的影响

将2.0 g预处理好的树脂装入玻璃层析柱中，以3 mL／min上样速度上样，用体积分数为40%的乙醇溶液分别以0.5，1，2，3，4，5 mL／min的速度洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中黄酮类物质的含量，确定最佳的洗脱速率。

不同洗脱速率对大孔吸附树脂解吸率的影响结果如图3所示。

图3 洗脱速率对大孔吸附树脂解吸率的影响

由图3可知，当洗脱速率为4 mL／min时解吸率最高，因为洗脱速率过低，黄酮类物质的死吸附过多，解吸率不高；洗脱速率过高，黄酮类物质还未完全吸附就被洗脱下来，致使解吸率低，所以最佳洗脱速率为4 mL／min。

2.6 柱径比对大孔吸附树脂解吸率的影响

将预处理好的树脂2.0 g分别装入柱径比为1∶10，1∶15，1∶20的玻璃层析柱中，以3 mL／min上样速度上样，用体积分数为40%的乙醇溶液以4 mL／min洗脱速率进行洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中黄酮类物质的含量，确定最佳柱径比。

不同柱径比对大孔吸附树脂解吸率的影响实验结果如图4所示。由图4可知，柱径比为1∶10时，大孔吸附树脂对黄酮类物质的解吸率最高，所以确定最佳柱径比是1∶10。

图4 柱径比对大孔吸附树脂解吸率的影响

3 结论

(1)以含羞草种子中总黄酮吸附量和洗脱率为评价指标，研究Diaion HP–20大孔吸附树脂分离纯化含羞草黄酮类物质的工艺条件，研究确定最佳的条件为上样流速3 mL／min、洗脱液为40%乙醇溶液、柱径比1∶10、洗脱流速4 mL／min。

(2)本实验建立的Diaion HP–20大孔吸附树脂分离纯化含羞草黄酮类物质的方法简单可行，且大孔吸附树脂能够重生，利用率高，消耗树脂少，再生简单，该法具有较好的应用前景。

［1］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海：上海科学技术出版社，1997: 1 771.

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［4］吴立军.天然药物化学［M］.5版.北京：人民卫生出版社，2007: 30–31.

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