桦褐孔菌总三萜提取工艺的研究

2015-12-24 03:30戚月婷玄光善
应用化工 2015年5期
关键词:孔菌三萜类异丙醇

戚月婷,玄光善

(青岛科技大学 药学系,山东 青岛 266042)

桦褐孔菌(Inonotus obliquus)又名桦树菇、西伯利亚灵芝,中文学名为白桦茸。在外文资料中,其学名常以Inonotus obliquus(Fr. )Pilat 出现[1]。桦褐孔菌是一种极其珍贵的药用真菌,属多孔菌科褐卧孔菌属,是一种生长在寒带的木腐菌。桦褐孔菌菌核呈现瘤状、无柄,外表黑色或黑褐色,内部黄褐色,老后表面深裂,很硬,干时脆。野生桦褐孔菌生于白桦、银桦等树的活立木的树皮下或砍伐后树木的枯干上。桦褐孔菌主要分布在北纬45 ~50°的中国的黑龙江和吉林、波兰、芬兰、北美北部、俄罗斯、日本北海道等地。桦褐孔菌是俄罗斯及东欧地区一带的民间药用真菌,其有效成分已经引起美国、韩国、日本等国科学家的高度重视。俄罗斯认为,桦褐孔菌是上帝赐给苦难人类的礼物。日本的研究人员高度评价桦褐孔菌为“万能药”。美国则把桦褐孔菌列入“特殊的天然物质”,作为未来宇航员们的饮品。

随着对桦褐孔菌化学成分的研究日渐深入,大量活性成分被分离出来,包括多糖、三萜类化合物、桦褐孔菌素、桦褐孔菌醇、栓菌酸、木质素类和黑色素类等200 多种化学成分。研究发现,桦褐孔菌具有抗癌、防治糖尿病、抗衰老、增强机体免疫、防治艾滋病等多种药理作用[2]。三萜类化合物作为桦褐孔菌的一种主要活性成分,可用于恶性肿瘤、糖尿病、肝病、心血管疾病以及艾滋病的预防和治疗[3]。研究发现,其主要有效成分为羊毛脂烷型四环三萜[4]。

三萜类化合物的结构比较复杂,而且性质不太稳定,温度太高会破坏其结构;难溶于水,易溶于有机溶剂。根据相似相容的原理,可选用极性相近的异丙醇作为提取溶剂[5]。超声波辅助提取法,作为一种新技术,是利用超声波产生的高速、强烈的空化效应和搅拌作用,破坏药材细胞,促进溶剂渗透到药材细胞中,大大缩短了提取时间。此技术效率高、节省溶剂,尤其对植物细胞壁内活性物质的提取具有优势[6]。本实验采用超声辅助-回流提取法提取桦褐孔菌总三萜,以获得最佳提取工艺参数,为后续的纯化分离及工业化生产奠定基础。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

桦褐孔菌,购于吉林长白山,干燥、粉碎、过40目筛后保存;齐墩果酸对照品(Sigma 公司,纯度>98%);香草醛、冰醋酸、高氯酸、异丙醇等均为分析纯。

FW100 型高速万能粉碎机;HB-6 型磁力搅拌恒温水浴锅;RE-5 型旋转蒸发仪;KH-250DB 型数控超声波清洗器;UV762 型紫外-可见分光光度计。

1.2 实验方法

准确称取1.00 g 桦褐孔菌粉,按料液比1 ∶10 g/mL加入异丙醇,在90 Hz、50 ℃的条件下超声30 min,然后加热回流提取2 h。减压过滤,滤液旋蒸除去溶剂。用甲醇定容至50 mL 容量瓶用于含量测定。

1.3 分析方法

1.3.1 标准曲线的绘制 以齐敦果酸为标准品,采用香草醛-冰醋酸-高氯酸分光光度法进行总三萜含量测定[7-8]。准确称取齐墩果酸标准品10.0 mg,置于50 mL 容量瓶,用甲醇稀释至刻度,并摇匀,即得质量浓度为0.2 mg/mL 的标准品溶液。准确移取齐墩果酸标准品溶液0,0. 10,0. 20,0. 30,0. 40,0.50,0.60,0.70 mL,分别加入10 mL 具塞试管中,水浴挥尽溶剂,然后加入0.3 mL 新鲜配制的质量分数5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL 高氯酸,60 ℃水浴中反应20 min,流水冷却至室温,加冰醋酸至10 mL,摇匀,在550 nm 波长处测定吸光值。以齐墩果酸质量x 为横坐标,吸光度y 为纵坐标,绘制标准曲线,见图1。

图1 三萜类化合物标准曲线Fig.1 Standard curve of triterpenoids

由图1 可知,标准曲线的线性回归方程为y =3.524 6x-0.002 2,相关系数R2=0.999 2。结果表明,齐墩果酸在0 ~0.14 mg 范围内与吸光度线性关系良好。

1.3.2 含量测定 准确移取0.1 mL 提取液,水浴挥干,按照绘制标准曲线的操作方法测定样品在550 nm 波长时的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 定性分析

三萜类化合物的定性分析采用氯仿-浓硫酸显色反应[9],取一定量的桦褐孔菌异丙醇提取物,溶于氯仿,加入浓硫酸,氯仿层呈现红色,说明有三萜类化合物存在。将氯仿层点样在滤纸上,在254 nm的紫外分析仪下可以观察到绿色荧光现象,说明提取液中有三萜类化合物存在。

2.2 单因素实验

2.2.1 物料比对总三萜得率的影响 物料比对总三萜得率的影响,见图2。

图2 物料比对总三萜得率的影响Fig.2 Effects of material-liquid ratio on the yield of total triterpenoids

由图2 可知,随着物料比逐渐增大,总三萜得率先增大后减小,在物料比为1∶10 g/mL 时,达到最大值。2.2.2 提取温度对总三萜得率的影响 提取温度对总三萜得率的影响,见图3。

图3 提取温度对总三萜得率的影响Fig.3 Effects of extraction temperature on the yield of total triterpenoids

由图3 可知,随着温度的不断升高,总三萜得率随之增加,70 ℃时,得率最高。在70 ~90 ℃的温度范围内,得率相对稳定。过高的温度会对三萜类化合物造成破坏。所以最佳提取温度选择80 ℃。

2.2.3 提取时间对总三萜得率的影响 提取时间对总三萜得率的影响,见图4。

图4 提取时间对总三萜得率的影响Fig.4 Effects of extraction time on the yield of total triterpenoids

由图4 可知,总三萜得率随提取时间的延长先增大后减小,2 h 时达到最大值。原因可能是,提取时间>2 h 后,杂质也会被溶出到提取溶剂中。

2.2.4 提取次数对总三萜得率的影响 提取次数对总三萜得率的影响,见表1。

表1 提取次数对总三萜得率的影响Table 1 Effect of extraction times on the yield of total triterpenoids

由表1 可知,第一次提取的得率比较高,第二次及第三次的得率低很多。而且,多次提取会严重浪费时间和能源,也增加了后续浓缩工艺的难度。因此,提取1 次即可。

2.3 正交实验结果

在单因素实验的基础上,以总三萜得率为考察指标,采用L9(34)正交实验进行优化。因素水平见表2,结果见表3。

表2 正交实验因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test

表3 正交实验结果Table 3 The results of orthogonal test

由表3 可知,影响桦褐孔菌总三萜得率的因素程度大小依次为A >B >C,即物料比>提取温度>提取时间。最优组合为A2B3C3,即10 倍量异丙醇、提取温度80 ℃、提取时间2.5 h。

考虑到提取时间对总三萜得率的影响最小,而且>2 h 后,总三萜得率无明显增加,从节约时间和能源的角度考虑,工业化生产时可采用10 倍量异丙醇,提取温度80 ℃,提取时间2 h。

2.5 验证实验

为进一步考察最优提取工艺的稳定性,在该条件下,即物料比1∶10 g/mL、提取温度80 ℃、提取时间2 h,进行3 次重复实验,结果见表4。

表4 验证实验结果Table 4 The results of proof test

由表4 可知,平均得率为1.42%,相对标准偏差RSD 为2.14%,数据相对稳定,表明该最佳提取工艺合理可行。

3 结论

用异丙醇提取桦褐孔菌总三萜的最佳工艺为:料液比1∶10 g/mL,提取温度80 ℃,提取时间2 h。采用该提取工艺提取桦褐孔菌总三萜,其得率可达1.42%。

[1] 黄年来.俄罗斯神秘的民间药用真菌-桦褐孔菌[J].中国食用菌,2002,21(4):7-8.

[2] 李根培,朴惠善.桦褐孔菌化学成分与功能特性的研究进展[J].中国食用菌,2010,29(4):3-4.

[3] 张小青,戴玉成. 中国真菌志(锈革孔菌科)[M]. 北京:科学出版社,2005:92-93.

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