种植窗期uNK对血管生成的影响及子宫动脉血流与胚胎种植的相关性研究

刘新贵　孙莹璞　郭艺红　(郑州大学第一附属医院生殖中心，郑州450052)



种植窗期uNK对血管生成的影响及子宫动脉血流与胚胎种植的相关性研究

刘新贵孙莹璞郭艺红(郑州大学第一附属医院生殖中心，郑州450052)

［摘要］目的:探讨体外受精-胚胎移植患者种植窗期子宫内膜自然杀伤细胞(uNK)对子宫内膜微血管的影响及子宫动脉搏动指数与胚胎种植的关系。方法:回顾性分析本院2009年1月至2013年7月实施体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的37例患者的临床资料，根据是否妊娠成功及至少2次行IVF-ET失败分为成功组(26例)和失败组(11例)，比较两组研究对象种植窗期的子宫内膜uNK细胞标记物CD56+、子宫动脉搏动指数、血管内皮标记物F8因子、ɑ平滑肌肌动蛋白(ɑSMA)及重链肌球蛋白(SMM)的表达差异及其相互关系。结果:成功组的基础FSH 3.52±0.68(mU/ml)、基础窦卵泡9.44±2.53(个)与失败组比较差异均不具有统计学意义(P＞0.05)。成功组的uNK细胞27.18±5.94(%)、MVD 6.79±1.74(%)、ɑSMA 33.72±4.19 (%)、SMM 25.19±5.83(%)表达率均显著高于IVF-ET助孕失败组(P＜0.05)。种植窗期37例患者的子宫内膜uNK细胞比例与MVD数目、ɑSMA及SMM着色细胞数比例均呈显著的正相关性［(r = 0.472，P = 0.000＜0.005)、(r = 0.426，P = 0.000＜0.005)、(r=0.512，P=0.000＜0.05)］。成功组种植窗期的子宫动脉PI= 0.94±0.28，失败组的PI= 0.87±0.29，两组比较差异不具有统计学意义(t=0.688，P=0.493＞0.05)。结论:种植窗期的子宫内膜组织中自然杀伤细胞与子宫内膜血管生成具有显著的相关性，可能与成功妊娠具有一定的关系;子宫动脉PI与妊娠结局是否成功关系不明显。

［关键词］体外受精-胚胎移植;种植窗期;子宫内膜;自然杀伤细胞;子宫动脉搏动指数;胚胎种植

Study on correlation of implantation window phase effect of uNK on angiogenesis and uterine artery blood flow and embryo implantation

LIU Xin-Gui，SUN Ying-Pu，GUO Yi-Hong.Reproductive Center of the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China

［Abstract］Objective: In vitro fertilization and embryo transplantation in patients with endometrial implantation window phase of natural killer cell (uNK ) influence on the endometrial microvascular and uterine artery pulsatility index and embryo implantation.Methods: A retrospective analysis of our hospital from January 2009 to July 2013 the implementation of in vitro fertilization and embryo transfer(IVF-ET) clinical data of 37 patients，according to whether the success of pregnancy and at least 2 times for IVF-ET failure into success group(26 cases) and the failure group(11 cases)，compared two groups of research object during the window of implantation in the uterus endometrial uNK cell marker CD56+，uterine artery pulsatility index，vascular endothelial marker F8 factor，alpha smooth muscle actin(alpha SMA) and myosin heavy chain(SMM) and the relationship between the expression of difference.Results: Success group based FSH 3.52±0.68(mU/ml)，basal antral follicles of 9.44±2.53 compared with the failure group differences were not statistically significant(P＞0.05) .The successful group of uNK cells of 27.18±5.94(%)，MVD 6.79±1.74 (%)，αSMA 33.72±4.19(%)，SMM 25.19±5.83(%) were significantly higher than the expression rate of IVF-ET assisted reproductive failure group(P＜0.05) .The number of uNK cells，the proportion of endometrium during the window of implantation and MVD of 37 patients with αSMA and SMM coloring cell number proportion were positive correlation significantly(r= 0.472，P= 0.000＜0.005)，(r= 0.426，P=0.000＜0.005)，(r=0.512，P=0.000＜0.05) .Success group during the window of implantation in the uterine artery PI= 0.94±0.28，PI=0.87±0.29 failure group，differences between the two groups was not statistically significant(t = 0.688，P= 0.493＞0.05) .Conclusion: During the window of implantation in the endometrium of natural killer cells and endometrial angiogenesis was significantly associated with successful pregnancy，may have a certain relationship; uterine artery PI and pregnancy outcome successful has no obviously relationshhip.

［Key words］In vitro fertilization and embryo transfer; Implantation window phase; Endometrium; Natural killer cell; Uterine artery pulsatility index; Embryo implantation

体外受精-胚胎移植(In vitro fertilization-embryo transer，IVF-ET)是目前已有几十年临床应用历史的辅助生殖技术，其对不孕不育症的治疗取得了令人满意的效果，但是还有部分患者接受多次IVF-ET治疗仍未成功妊娠。据报道，大约有一半不孕患者IVF-ET治疗失败，且原因至今不清，可能与女性子宫腔内的微环境有关［1］。因此，目前越来越多的学者研究种植窗期女性子宫内的微环境变化对胚胎种植结局的作用及其影响因素。uNK细胞是子宫内独有的细胞，其细胞表型为CD56+CD16－。有文献报道，uNK细胞与患者种植窗期微血管的生成有一定的关系［2］。本文旨在研究种植窗期女性子宫内uNK细胞与患者微血管生成和血流间的关系。

1　对象与方法

1.1研究对象以本院2009年1月至2013年7月实施体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的37例患者作为研究对象，根据是否妊娠成功及至少2次行IVFET失败分为成功组(26例)和失败组(11例)。成功组:年龄27～35岁，平均年龄(33.68±2.52)岁;不孕年限1～8年，平均年限(4.8±2.9)年。失败组:年龄28～36岁，平均年龄(34.12±1.46)岁;不孕年限1～9年，平均年限(5.0±2.2)年。两组患者的年龄、不孕年限差异均不具有统计学意义(P＞0.05)，均有可比性。

纳入标准:因输卵管堵塞、输卵管粘连、重度子宫内膜异位症等原因造成的不孕患者;经过输卵管再通术、整形术等治疗措施无效的患者;入选患者的基础卵泡雌激素(FSH)≤10 mU/ml，每一个治疗周期获得至少8枚卵子，至少5枚可用于胚胎移植手术;所有患者均接受中长期黄体方案;均为自愿接受IVF-ET治疗;治疗实施前均签订知情同意书。

排除标准:输卵管积水、卵巢反应不良及子宫内膜受损等严重影响胚胎移植成功的因素;合并免疫类风湿疾病(类风湿性关节炎、系统红斑狼疮等)疾病的患者;合并严重感染、生殖器解剖功能严重障碍、内分泌严重异常、染色体异常、甲状腺疾病等因素引起的不孕患者。

1.2标本采集在患者月经周期的第10天使用尿黄体生成素(LH)试纸测量其尿液中LH的浓度，在LH峰值后的第7～9天采用阴道超声检查子宫动脉的搏动情况，刮取少量宫腔内膜组织，福尔法琳溶液浸泡，石蜡包埋制作切片。

1.3指标检测方法切片去除石蜡后浸泡于水中，加入0.1 g/L的蛋白酶K，37℃下放置30 min;水洗后H2O2甲醇溶液浸泡半小时，双蒸水冲洗，然后泡于PBS中5 min。加入兔抗人CD56+、F8因子、αSMA、SMM的相关抗原多抗隆抗体(均购自北京中山生物科技有限公司)，4℃过夜。然后用PBS冲洗3次，每次10 min。加入生物素标记的1∶100稀释的二抗，37℃孵育半小时，PBS冲洗3次，每次10 min。3-氨基-9-乙基咔唑显色试剂进行10 min的显色，自来水冲洗后，重复染色，封片。1∶100稀释的一抗为PBS的切片为阴性对照，CD56+、F8因子、αSMA、SMM的相关抗体为一抗的切片为阳性对照。

1.4结果评定标准子宫内膜微血管(MVD)计数:血管内皮细胞标志物F8因子相关抗原染色后，采用显微镜(BX51型)对组织切片进行观察，DP-70进行图像采集，在显微镜(×100倍)下找出MVD着色较为密集的区域，再于×400倍的显微镜下进行MVD计数，求取其平均值。

CD56+、ɑ平滑肌肌动蛋白(ɑSMA)、重链肌球蛋白(SMM)染色全阴性，切片中所有细胞均为着色，保持与背景颜色一致的色彩。

CD56+、ɑ平滑肌肌动蛋白(ɑSMA)、重链肌球蛋白(SMM)染色阳性，uNK细胞标记物CD56+位于包膜间质或细胞质，ɑ平滑肌肌动蛋白(ɑSMA)、重链肌球蛋白(SMM)在血管内皮着色呈清楚的棕色，选取着色较为清楚的5个视野，对视野中CD56+、ɑSMA、SMM细胞进行计数，计算百分率，取均值。

子宫动脉血管搏动指数(PI)的测量，本研究采用美国GE公司生产的三维彩超仪进行测量，PI=(子宫动脉收缩期最大血流速度-舒张期最小血流速度) /平均血流速度。

1.5统计学分析统计分析在SPSS17.0中进行。计量资料以(x ±s)表示，两组间比较采用两独立样本t检验;相关性分析采用Pearson分析法。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2　结果

表1　两组研究对象的基础FSH及窦卵泡数量情况(x ±s)Tab．1 Basis of FSH and antral follicle count in two groupsof subjects(x±s)

2.1两组研究对象的基础FSH及窦卵泡数量情况

成功组的基础FSH(3.52±0.68) mU/ml、基础窦卵泡(9.44±2.53)个与失败组比较差异均不具有统计学意义(P＞0.05)。详见表1。

2.2两组研究对象的uNK细胞、MVD数目、ɑSMA及SMM着色细胞数比较成功组的uNK细胞27.18±5.94 (%)、MVD 6.79±1.74 (%)、ɑSMA 33.72±4.19(%)、SMM 25.19±5.83(%)表达率均显著高于IVF-ET助孕失败组(P＜0.05)，详见表2。图1A为uNK细胞在种植窗期子宫内膜的表达，图1B为子宫内膜微血管计数(MVD%)，图1C为ɑSMA在子宫内膜内皮血管上的表达情况，图1D为SMM在子宫内膜内皮血管上的表达情况。

2.3 37例行IVF-ET患者的uNK细胞、MVD数目、ɑSMA及SMM着色细胞数比例相关性分析种植窗期37例患者的子宫内膜uNK细胞比例与MVD数目、ɑSMA及SMM着色细胞数比例均呈显著的正相关性(r = 0.472，P = 0.000＜0.005)、(r = 0.426， P= 0.000＜0.005)、(r = 0.512，P = 0.000＜0.05)。见图2。

2.4两组研究对象的PI值差异成功组种植窗期的子宫动脉PI = 0.94±0.28，失败组的PI = 0.87± 0.29，两组比较差异不具有统计学意义(t = 0.688，P=0.493＞0.05)，见图3。

表2　两组研究对象的uNK细胞、MVD数目、αSMA及SMM着色细胞数比较(x ±s)Tab．2 Comparison of number of uNK cells，number of MVD，αSMA and SMM staining alpha of two groups (x±s)

图1　 uNK细胞、MVD数目、αSMA及SMM着色Fig．1 Expression of uNK cells，MVD counting，αSMA and SMM staining

图2　 uNK细胞与MVD、αSMA、SMM的相关性Fig．2 Correlation of uNK cells and MVD，uNK cells and αSMA，uNK cells and SMM

图3　两组研究对象的PI值差异Fig．3 Success group and failure group PI value

3　讨论

体外受精-胚胎移植，又可称之为试管婴儿，是临床上治疗不孕症的重要手段［3］。IVF-ET的过程主要为先采用药物促进多个卵泡发育成熟，分泌多个卵子［4］;然后借助阴道超声取出成熟的卵子;短时间内将卵子与已处理过的精子体外共同培养，形成受精卵，继续培养一段时间待其发育为胚胎后即可将其植入到母体的子宫腔内。种植窗期是患者能否成功妊娠的关键时期，也是胚胎能否在子宫腔内存活的关键时期。女性子宫腔内的微环境是决定胚胎是否可以种植成功的关键。

有研究报道，uNK细胞在没有妊娠女性的子宫内膜中其数量是随着月经周期的变化而变化的，卵泡成熟分泌卵子前，uNK细胞数量较少，但在卵子排出黄体中期的时候其数量开始增加，一直到分泌晚期其值达到最大，而且该细胞十分贴近内膜的腺体和螺旋血管［5］。本文成功组的uNK细胞数目明显高于助孕失败组患者，并且其空间分布情况与上述报道一致，通常采用微血管密度(MVD)评估血管生成情况［6］，如果MVD的值越高说明新生的微血管越多。因此，检测患者种植窗期子宫内膜的MVD值对判断子宫内膜能否成功容受胚胎种植具有重要意义。本文成功组患者子宫内膜中的MVD数量明显高于助孕失败组患者，且MVD与uNK细胞的表达间存在正相关关系，说明uNK细胞数量越多，内膜中新生的微血管越多，uNK细胞对微血管的生成有一定的促进作用。

胚胎在子宫腔内种植及其生长发育均需要充分的血供和营养物质，可明显增大子宫循环血液的需求量［7］，故该时期子宫内膜多发生血管重塑，主要是通过血管扩张和形成新的血管来应答该种需求［8］。但子宫内膜血管的数量、分布和功能受到严格的调控，伴随着月经周期发生变化，该变化通常有规律可循。只有血管结构中含有血管平滑肌的微血管才可调节子宫内膜中螺旋小动脉的生成和血流量。αSMA、SMM可作为血管平滑肌的分化指标，用于评估血管的成熟度。本研究结果显示，成功组患者ɑSMA和SMM的表达率均显著高于IVF-ET助孕失败组，且其与uNK细胞比例呈显著的正相关性，与相关文献报道一致［9］。

胚胎种植过程中的关键因素之一即是子宫内膜的血液供应，月经结束后遗留的螺旋动脉断端可以芽生出新的微血管，保证子宫内膜的血液供应。如果母体子宫的血液供应发生病变，特别是过早的形成母体循环，可使胚胎种植部位的血运发生障碍，血液明显增加，导致该部分发生过度氧化应激反应阻碍胚胎的种植和生长发育。目前，人们对于子宫动脉搏动指数对妊娠结局的影响仍有很大的争议［10］。本文两组患者在种植窗期间子宫动脉搏动指数无明显差异，只是检查比较两组患者子宫动脉的搏动指数并不能全面准确地反应子宫内膜螺旋动脉及其分支、微血管的血运情况，无法准确评估患者的妊娠结局。

综上所述，种植窗期的子宫内膜组织中uNK细胞与子宫内膜新生血管的生成间存在正相关关系，可能与胚胎的成功种植有一定的关系，但子宫动脉搏动指数对胚胎种植的影响需要进一步扩大样本量深入研究。

参考文献:

［1］宗滕，钟婷，郭美君，等.子宫自然杀伤细胞在子痫前期母胎界面的分布变化［J］．广东医学，2014，35(4) : 513-516.

［2］魏静波，翁静.米非司酮药物流产后子宫出血的相关性研究［J］．现代预防医学，2011，38(12) : 261-264.

［3］赵静，罗莉，王卉芳，等.种植窗期子宫内膜自然杀伤细胞对内膜血管生成的影响及子宫动脉血流与体外受精胚胎移植结局的相关性［J］．西安交通大学学报(医学版)，2014，35 (3) : 385-389.

［4］钟婷，宗滕，张鹏，等.Lectin法分析uNK细胞在人妊娠母胎界面的分布变化［J］．南昌大学学报(理科版)，2013，37 (3) : 267-271.

［5］李素春，冯苗，潘萍，等.子宫内膜息肉患者增殖期及种植窗期性激素及激素受体的改变及意义［J］．生殖与避孕，2014，34(12) : 986-992.

［6］刘倍余，李洁，夏婷婷，等.不明原因反复种植失败患者“种植窗”期血清雌二醇、孕酮增高与肿瘤坏死因子受体作用因子3表达异常的关系［J］．中国实用妇科与产科杂志，2014，30 (6) : 479-483.

［7］Blois SM，Klapp BF，Barrientos G.Decidualization and angiogenesis in early pregnancy: unravelling the function of DC and NK cells［J］．Reprod Immunol，2011，88(2) : 86-92.

［8］李秋华，余敏，陈雷宁，等.围着床期子宫内膜微血管密度评价子宫内膜容受性［J］．南方医科大学学报，2011，31(8) : 1365-1368.

［9］刘红梅，何燕妮，邢福祺.子宫内膜血流灌注在评价子宫内膜容受性中的作用［J］．中国医学影像学杂志，2012，20(4) : 282-286.

［10］Li G，Huang W，Xia Q，et al．Role of uterine natural killer cells in angiogenesis of human decidua of the first-trimester pregnancy ［J］．China C Life Sci，2008，51(2) : 111-119.

［收稿2015-01-28修回2015-02-06］

(编辑许四平)

·教学园地·

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．025

作者简介:刘新贵(1969年－)，男，主管技师，主要从事生殖与基础内分泌研究。

文章编号1000-484X(2015) 10-1407-04

文献标志码A

中图分类号R714.8