血蓝蛋白是中华绒鳌蟹重要的高分子量过敏原①

张盈莹　朱黎娜　李韶深侯丽英　李会强　(天津医科大学医学临床免疫学教研室，天津300203)



血蓝蛋白是中华绒鳌蟹重要的高分子量过敏原①

张盈莹朱黎娜李韶深②侯丽英李会强(天津医科大学医学临床免疫学教研室，天津300203)

［摘要］目的:证明血蓝蛋白是中华绒螯蟹的一种重要的高分子量过敏原。方法:采用裂解液法提取蟹总蛋白，通过SDS-PAGE、二维电泳及Western blot分析蟹中过敏原组分并进行比对，再通过质谱分析鉴定未知过敏原。以临床中华绒螯蟹过敏患者的血清作为识别抗体，通过斑点免疫印记实验证明疑似蛋白的致敏特性。结果:通过SDS-PAGE及二维电泳分析，证明本实验所提取的蟹总蛋白组分完全。Western blot结果显示，中华绒螯蟹至少有18种与阳性血清反应的组分，其中，70～80 kD处两个蛋白处于同一等电点，可能为同一蛋白，且反应斑点清晰;质谱分析结果显示疑似蛋白为血蓝蛋白;斑点免疫印记结果显示血蓝蛋白与患者血清的反应频率为61%。结论:血蓝蛋白为中华绒鳌蟹中一种重要的高分子量过敏原。

［关键词］中华绒鳌蟹;特异性sIgE;血蓝蛋白;质谱分析;过敏原

①本文为国家自然科学基金面上项目课题(No.81371882)。

②天津市中医药研究院附属医院，天津300120。

Hemocyanin is an important high-molecular-weight allergen of Eriocheir sinensis

ZHANG Ying-Ying，ZHU Li-Na，LI Shao-Shen，HOU Li-Ying，LI Hui-Qiang.College of Medical Laboratory，Tianjin Medical University，Tianjin 300203，China

［Abstract］Objective: To prove hemocyanin is an important high-molecular-weight allergen from Eriocheir sinensis.Methods: The proteins were extracted from Eriocheir sinensis tissue with lysate extraction method .The protein components were analyzed by SDSPAGE，two-dimensional electrophoresis and Western blot.Serum IgE from allergic donors identified a candidate protein，which was characterized by MALDI-TOF/TOF.The immune property of the candidate protein was tested using Dot-blot.Results: By SDS-PAGE and two-dimensional electrophoresis analysis，we prove that the native protein components were completely.According to the Western blot result，at least 18 components could react with the positive serum.Among them，two 70－80 kD proteins had the same isoelectric point.So，may be they were the same protein.MALDI-TOF/TOF analysis results showed that the suspected proteins were hemocyanin.A sensitization frequency of 61% was observed in Eriocheir sinensis patients by Dot-blot.Conclusion: Hemocyanin was identified as an important high-molecular-weight allergen from Eriocheir sinensis.

［Key words］Eriocheir sinensis; Specific sIgE; Hemocyanin; MALDI-TOF/TOF analysis; Allergen

食物过敏是世界范围内常见的变态反应，近年来发病率不断上升［1］。食物过敏是由IgE介导的Ⅰ型过敏反应，可引起腹泻、呕吐、水肿、皮炎、哮喘等临床症状，严重可引起休克，甚至危及生命。流行病学研究表明:发达国家的成人食物过敏性疾病的患病率已高达3%，儿童为6%［2］。其中，甲壳类食物作为粮食农业组织(Food and Agriculture Organization，FAO) /世界卫生组织(World Health Organization，WHO)认定的8大过敏食物之一，被认为是引起食物过敏的常见原因［3］。

与大多数的食物过敏不同，甲壳类食物通常引起的食物过敏是终生的，而且现在对于甲壳类食物过敏的治疗，主要依靠于特异性免疫治疗(Specific Immunotherapy，SIT)，所以对甲壳类食物过敏组分的确定极其重要［4］。甲壳类食物中含有多种蛋白质，过敏原组分十分复杂［5］。其中，原肌球蛋白(Tropomyosin，TM)是最早被发现的甲壳类动物过敏原［6，7］。近年来，精氨酸激酶、肌球蛋白轻链和肌质钙结合蛋白也相继被鉴定为甲壳类食物的主要过敏原［8-10］。蟹是甲壳类食物的重要组成，种类繁多。中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)原产于中国，是中国特别是长江流域最经济、最重要的淡水水生物种之一。在2005年，中国中华绒螯蟹的产量已经达到了4.0×105t［11］，而且在过去的十年中，随着蟹文化的发展，中华绒螯蟹越来越受到人们的喜爱。因此，由中华绒螯蟹引起的食物过敏在我国较为常见。现已报道的中华绒螯蟹的主要过敏原只有原肌球蛋白和精氨酸激酶［12］，对其他的过敏原组分未见报道［13］。

我们先前对梭子蟹过敏原的分析中，发现除了已明确的36 kD、40 kD的原肌球蛋白、精氨酸激酶外，高分子量的蛋白也占有很大比例。其中，70 kD 和74 kD的蛋白百分比最高，且与过敏患者血清反应，显示多条反应条带，且颜色较深［14］。由此，本文探究在中华绒螯蟹中，高分子量蛋白是否也是重要的过敏原，并进一步丰富人类对中华绒螯蟹过敏组分的认识。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器垂直板型电泳仪、电转印槽、二维电泳仪、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司) ;低温高速冷冻离心机(Beckman公司) ;凝胶成像系统(ChampGel公司)。

1.1.2试剂硫脲、碘乙酰胺、载体两性电解质IPG-buffer、pH为3～10的干胶条购自于美国GE公司;血蓝蛋白、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、过硫酸铵、十二烷基磺酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、吐温-20(Tween-20)均购自美国Sigma公司;蛋白分子质量标准SM0671(加拿大Fermentas公司) ;聚偏二氟乙烯(PVDF) (美国Millipore公司) ;鼠抗人IgE-AP抗体、鼠抗人IgE-HRP抗体(美国Jackson Immunoresearch公司)。

1.2方法

1.2.1血清标本随机选取天津市长征医院的蟹过敏患者23例，男14例，女9例，阳性血清纳入标准为患者有典型过敏史，临床确诊为蟹类过敏，血清总IgE＞100 kU/L，血清蟹sIgE＞0.35 kU/L等。阴性对照血清来自健康体检人群，纳入标准为无过敏家族史，无食物过敏史，血清总IgE＜100 kU/L。采集研究对象静脉血，分离血清并分装，－20℃保存备用。

1.2.2蟹总蛋白的提取中华绒螯蟹购买自天津市三义庄菜市场，现杀去壳、取肌肉组织。取5 g新鲜中华绒螯蟹肌肉组织，剪碎，在液氮中充分研磨至粉末状，用匀浆器匀浆，加入5 ml裂解液［7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%(w/v) CHAPS，65 mmol/L DTT，40 mmol/L Tris］，震荡混匀后，于冰上静置30 min，使蛋白质充分溶解到裂解液中。使用低温高速冷冻离心机于4℃下12 000 r/min离心30 min，取上清液即为蟹总蛋白粗提液。分装，－80℃保存备用。

1.2.3 SDS-PAGE及二维电泳分析采用SDSPAGE技术，用不连续系统进行垂直板电泳，对蟹总蛋白粗提液组分进行分析。浓缩胶为5%，分离胶为10%，蛋白样品与上样缓冲液1∶5混合，煮沸5 min，每孔上样12 μl，65 V恒压堆积20 min，135 V恒压分离，待溴酚蓝指示到达分离胶底部，电泳完毕，考马斯亮蓝染色1 h，脱色液充分洗脱。

参照文献［15］方法，采用二维电泳进一步对蟹总蛋白粗提液进行分析。水化上样及第一向等电聚焦:取100 μl蟹蛋白粗提液与400 μl水化上样缓冲液混合，沿胶条槽自左而右均匀加入125 μl样品，由阳性端开始放下胶条，慢慢覆盖在蛋白样品上，并轻轻赶走胶条下的气泡，使水化液浸湿整个胶条，然后在胶条上缓慢覆盖2 ml矿物油。盖上盖子，设定等电聚焦程序。胶条的平衡与第二向SDS-PAGE电泳:将胶条取出，分别在平衡缓冲液Ⅰ和平衡缓冲液Ⅱ中平衡10 min后，备用。制备10%的分离胶，待充分凝固后，用约50℃的0.5%低熔点琼脂糖封胶液灌入玻璃板缝隙中，轻轻把胶条推到分离胶面上，待琼脂糖凝固后，即可开始电泳。65 V恒压10 min，135 V恒压分离，直到溴酚蓝跑到玻璃板底部为止。考马斯亮蓝染色1 h，脱色液充分洗脱。拍照，分析。

1.2.4 Western blot分析将蟹蛋白粗提液分别进行一维、二维电泳后，采用半干转方法，15 V恒压，转印30 min，将蟹蛋白转印到PVDF膜上，然后置于5%的脱脂奶中室温封闭2 h，用TBST洗3次，每次10 min。加入用TBST 1∶9稀释的单例阳性血清，4℃反应过夜，用TBST洗3次，每次10 min。加入1∶1 000稀释的鼠抗人IgE-AP作为标记二抗，室温反应2 h。TBST洗3次，每次10 min，加入AP底物避光显色10 min，将膜取出用蒸馏水洗净，吹干后观察显色点。

1.2.5质谱分析将二维电泳上疑似过敏原进行抠点、漂洗、脱色、脱水、干燥、胶内酶切、肽段的抽提和纯化等步骤，得到的样品由北京蛋白质组研究中心协助用蛋白质串联质谱(MALDI-TOF/TOF)进行检测，获得被检测样品的肽质量指纹图谱。利用Mascot软件搜索NCBI数据库，寻找匹配的相关蛋白质。

1.2.6斑点免疫印记以血蓝蛋白作为包被抗原，阳性血清sIgE作为识别抗体，进行斑点免疫印记实验。方法如下:将血蓝蛋白用0.01 mol/L PBS溶解，终浓度为5 mg/ml。将2 μl血蓝蛋白点于NC膜上，待其干燥，羊抗鼠IgG作为阳性对照，PBS作为阴性对照。用TBST洗10 min，然后将NC膜放入5%的脱脂奶中室温封闭2 h，TBST洗3次，每次10 min。将封闭好的NC膜分别与24份1∶9稀释的阳性及阴性血清室温反应2 h，TBST洗三次，每次10 min。加入1∶1 000稀释的鼠抗人IgE-HRP作为二抗，室温反应2 h。TBST洗3次，每次10 min，曝光，观察结果。

2　结果

2.1蟹蛋白粗提液蛋白组分分析蟹蛋白粗提液的SDS-PAGE结果如图1所示，至少有18条明显的蛋白条带。其中，20、34、40 kD处分别为已知的肌质钙结合蛋白、原肌球蛋白、精氨酸激酶。在70～90 kD之间有四条明显的条带，但该分子量范围内的蛋白尚未见相关报道。二维电泳分析结果与SDSPAGE结果一致，大部分蛋白组分的等电点在4～9之间，其中，25～45 kD之间的蛋白着色最深，含量最丰富，应多为已报道的原肌球蛋白及精氨酸激酶。在等电点5.2、70～80 kD处可分辨两个明显的点。结果与SDS-PAGE结果相符。

2.2蟹中过敏组分分析蟹总蛋白提取液经一维印记分析，结果如图2A所示，中华绒螯蟹过敏原中，除34 kD原肌球蛋白、40 kD精氨酸激酶外，55 kD以上的高分子量蛋白占有很大比例，且70～80 kD处反应条带较深。利用二维印记，使用混合阳性血清作为探针进一步分析，结果如图2B所示，25～45 kD处出现多个阳性反应点，与已报道的研究结果相符。同时，70～80 kD处出现了阳性反应点，证明该处蛋白是中华绒螯蟹中的过敏原。

Note: A.Western-blot analysis of extract of Eriocheir sinensis proteins．M.Marker; 1－6.Sera from 6 crab-allergic subjects; N.Negative serum; B.Two-dimensional Western blot analysis of extract of Eriocheir sinensis proteins.1.Suspected proteins.

图3　疑似蛋白肽指纹图谱Fig．3 Peptide Mass Finger Print of suspected proteins

2.3质谱分析结果对二维电泳70～90 kD处两个蛋白点进行质谱分析，肽指纹图谱及质谱结果如图3、表1所示，其中，图3A为疑似蛋白1，普库索取号为gi|334145788，预测分子量为78 390，等电点约为5.21，Mascot得分为107，有16个肽段可与中华绒螯蟹血蓝蛋白匹配;图3B为疑似蛋白2，Mascot得分为209，有29个肽段可以与中华绒螯蟹血蓝蛋白匹配。

3.4斑点免疫印记实验结果使用血蓝蛋白作为包被抗原，进行斑点免疫印记实验，结果如图4所示，在23例阳性血清中，14例与血蓝蛋白反应，9例无反应。血蓝蛋白的反应率为61%。

表1　匹配片段质谱分析结果Tab．1 MALDI-TOF/TOF results of matched peptides

Note: 1-23.Hemocyanin react with Sera from 23 crab-allergic subjects; P.Positive control; N.Negative control.

3　讨论

然而，由于蟹中含有极其丰富的蛋白质，且蛋白种类繁多，其中致敏原组分尚未完全揭示。通过与蟹过敏病人血清的Western blot实验发现，中华绒螯蟹中可与血清sIgE结合的过敏原组分多种多样，且尚未完全被阐明。本文的主要目的就是探寻中华绒螯蟹中未报道的过敏原。

通过SDS-PAGE分析，蟹总蛋白粗提液包含20、36、40、113 kD等主要过敏原，蛋白组份完整，且蛋白条带清晰，说明我们的蟹总蛋白粗提液可用于后续研究。除已报道的几种过敏原外，在70～90 kD间，有四条明显的蛋白条带，且该区域蛋白尚未见报道。随着蛋白质研究技术的逐步完善，双向电泳和质谱的联用已成为蛋白分析的核心技术，因此，我们采用二维电泳技术进行进一步分析，发现该分子量范围内的两个蛋白在同一等电点，推测可能为同一种蛋白。用混合阳性血清作为识别抗体，发现该处蛋白可与阳性血清反应，证明该蛋白为中华绒螯蟹的一种过敏原。胰酶消化后，对该处蛋白进行质谱分析，该处蛋白与中华绒螯蟹中血蓝蛋白相匹配，且Mascot得分均较高，证明该处蛋白均为血蓝蛋白，即血蓝蛋白是中华绒螯蟹的一种新型过敏原。

血蓝蛋白(Hemocyanin)是许多软体动物、节肢动物中一种的运输糖蛋白，具有酚氧化物酶活性和抗菌、抗癌功能，被认为是一种重要的免疫分子［18］。中华绒螯蟹中血蓝蛋白［19］cDNA长2 573 bp，其中2 064 bp为开放阅读框，编码688个氨基酸，计算得到的分子量为77 997.31 Da，理论上的PI值为4.93，血蓝蛋白与血红蛋白分子类似，也是一种多亚基组成的分子。

为了评估血蓝蛋白是否为中华绒螯蟹中的主要过敏原，我们需要确定血蓝蛋白与阳性血清的反应率。我们用血蓝蛋白作为包被抗原，进行斑点印记实验，发现血蓝蛋白的反应率为61%，证实血蓝蛋白为中华绒螯蟹的一种主要的过敏原。本文通过SDS-PAGE、二维电泳及Western blot分析蟹中过敏原组分并进行比对，再通过质谱分析鉴定中华绒螯蟹中70～90 kD处新型的过敏原———血蓝蛋白，并通过斑点免疫印记实验证明血蓝蛋白是中华绒螯蟹中的一种主要的过敏原。同时，探索了鉴定过敏原的方法，为中华绒螯蟹其他新型过敏原的发现、研究奠定了基础。更重要的是，通过对蟹类过敏原认识的深入，为过敏性疾病的检测提供更标准化、高质量的已知抗原，为研制新一代的检测试剂提供实验依据。

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在针对猝死病人进行抢救的过程中，心肺复苏是最有效的手段也是唯一的途径，在临床实践中，开展心肺复苏并在心肺复苏过程中加强治疗，能够改善患者的身体状态，为后续治疗做好准备工作。因此新时期十分有必要对心肺复苏中西医结合治疗热点进行分析，为进一步提高心肺复苏综合水平提供相应的支持。

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［收稿2015-01-20修回2015-04-22］

(编辑张晓舟)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．017

通讯作者及指导教师:李会强(1965年－)，男，教授，硕士生导师，主要从事标记免疫分析方法学和食物过敏实验室诊断领域的研究，E-mail: lihuiqiang1965@ 163．com。

作者简介:张盈莹(1991年－)，女，主要从事食物过敏实验室诊断领域的研究。

文章编号1000-484X(2015) 10-1375-06

文献标志码A

中图分类号R392.11