模拟金黄色葡萄球菌脂磷壁酸表位的初步筛选与鉴定①

王湘豫　黄钊霞　侯晓睿　朱　平　富　宁　刘北一(南方医科大学基础医学院免疫学教研室，广州510515)



模拟金黄色葡萄球菌脂磷壁酸表位的初步筛选与鉴定①

王湘豫黄钊霞侯晓睿朱平富宁刘北一
(南方医科大学基础医学院免疫学教研室，广州510515)

［摘要］目的:利用噬菌体展示肽库技术筛选并鉴定可模拟金黄色葡萄球菌细胞壁脂磷壁酸(LTA)的表位。方法:以抗LTA单抗为靶分子，采用液相法对噬菌体12线性肽库进行3轮淘选，夹心ELISA鉴定噬菌体克隆。对阳性噬菌体克隆进行DNA测序并推导氨基酸序列，选择优势序列合成线性肽，ELISA鉴定线性肽与抗体结合特异性。结果:经过三轮液相筛选，得到4个与抗LTA单抗特异性结合的阳性噬菌体克隆，序列分析显示阳性克隆展示4种不同序列。选择与单抗结合最好的序列GHxDFRQxxQPS合成线性短肽L2，ELISA结果显示L2能够与抗LTA单抗特异性结合。结论:利用噬菌体展示肽库筛选技术获得可模拟LTA表位的序列。

［关键词］金黄色葡萄球菌;噬菌体展示肽库; LTA;模拟肽

①本文受国家自然科学基金(31270980)和广东省自然科学基金(S2012010009562)资助。

Screening and identification of peptide mimics to lipoteichoic acid by phage displayed random peptide library

WANG Xiang-Yu，HUANG Zhao-Xia，HOU Xiao-Rui，ZHU Ping，Fu Ning，LIU Bei-Yi.Department of Immunology，School of Basic Medical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China

［Abstract］Objective: To screen epitope mimics to lipoteichoic acid from a random 12-mer phage display peptide library and identify the specificity of the mimotopes of LTA.Methods: The monoclonal antibody against LTA was used as a target to screen the 12-mer phage display peptide library and the specificity of phage clones were identified by sandwich ELISA.The amino acid sequences of positive phage clones were deduced from DNA sequencing.The specificity of synthetic peptide were identified by sandwich ELISA.Results: 4 clones were obtained after 3 rounds of screening.Amino acid sequence analysis revealed four different types of mimotope sequence.A linear peptide (GHxDFRQxxQPS)，named L2，which derived from positive sequence was synthesized.ELISA result indicates that L2 can bind to anti-LTA mAb specifically in a dose-dependent manner.Conclusion: The mimotopes of LTA were obtained by using the phage display technology.

［Key words］Staphylococcus aureus; Phage display peptide library; Lipoteichoic acid; Mimic peptide

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)是一种寄居于人体皮肤和黏膜的革兰氏阳性(G+)菌，是社区和院内感染的主要病原体之一［1］，除引发皮肤和软组织感染［2］，还可引发威胁生命的肺炎、骨髓炎、脑膜炎、心内膜炎和脓毒血症等［3］。近年来由于抗生素滥用导致细菌耐药程度日趋严重，尤其是耐甲氧西林和耐万古霉素的超级菌株的出现，给临床治疗带来极大困难。2013年中国CHINET细菌耐药性监测结果显示金黄色葡萄球菌中甲氧西林耐药株的平均检出率高达45.2%［4］。面对上述严峻形势，针对金葡菌的疫苗和免疫学治疗研究受到关注。然而目前尚无有效疫苗可预防金葡菌感染［5-7］，主要原因之一是金葡菌致病因子众多，不同致病因子在感染不同阶段表达并发挥不同作用［8］。因此寻找稳定表达于细菌表面的分子，以此作为构建联合疫苗的靶点成为现阶段研究方向［9］。

脂磷壁酸LTA(Lipoteichoic acid)是金葡菌上一保守性结构。由磷酸二酯键连接的磷酸甘油残基与1个膜载体共价连接的线性聚合物［10］。LTA是G+菌保守结构，无种属特异性，LTA不仅表达于金葡菌表面，还广泛存在于链球菌、粪球菌等革兰氏阳性菌细胞壁表面。LTA除维持细菌细胞壁完整结构外［11，12］，还是细菌表面重要黏附分子，参与细菌对宿主细胞的黏附作用［7］，诱发中性粒细胞及巨噬细胞产生活性氧、NO、酸性水解酶和防御素等［13］。研究表明LTA在固有免疫应答中发挥起着重要作用［14-16］。他们可被TLR2识别，并能与CD14分子结合，从而活化单核细胞释放大量促炎症介质，介导感染性休克和多器官功能衰竭［17］，然而LTA为非胸腺依赖性抗原(TI抗原)，免疫原性弱，难以引起有效的再次抗体应答和细胞免疫应答。在本研究中以液相法筛选噬菌体肽库，获得模拟LTA表位阳性序列，为后续构建针对金葡菌保守结构LTA的肽类疫苗候选提供实验数据。

1　材料与方法

1.1材料噬菌体随机12肽库(Ph.D.-12TMPhage display peptide library kit)，1×1013pfu/ml，购自New England Biolabs公司，受体菌为大肠杆菌E coli ER2738。蛋白G珠(protein G beads)购自Santa Cruz，辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体(HRP-抗M13抗体)购自GE Heathcare公司，金黄色葡萄球菌脂磷壁酸LTA(Lipoteichoic acid )购自Sigma公司，抗LTA单抗购自pierce公司，HRP-链酶亲和素Streptavidin购自Jackson ImmunoResearch，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)购自北京鼎国生物技术有限公司和广州斯佳生物技术有限公司，吐温-20(Tween-20)、聚乙二醇8000(PEG-8000)购自南方医科大学试剂中心。

1.2方法

1.2.1噬菌体肽库筛选采用液相筛选法。具体操作步骤如下:蛋白G珠与TBS(含0.1%Tween)轻柔悬匀，低速离心后去上清，以5 mg/ml BSA于4℃封闭60 min。5 μl噬菌体线性12肽库、50 μl 100 μg/ml抗LTA单抗及145 μl 0.1%TBST混匀室温孵育20 min。蛋白G珠封闭后，以0.1%TBST洗涤4次，将噬菌体与抗体混合物转入已洗涤的蛋白G珠中，轻柔混匀，室温继续孵育15 min。0.1%TBST洗涤10次，去上清加入含1 mg/ml BSA的0.2 mol/ L Gly-HCl(pH2.2)洗脱液，室温孵育10 min后低速离心，留取上清立即加入150 μl 1 mol/L Tris-HCl (pH9.1)进行中和。将第一轮洗脱产物侵染ER2738、测滴度、扩增纯化后，用于下一轮筛选。第2、3轮筛选除将洗液改为0.5%TBST以外，其余步骤同第一轮筛选。完成3轮筛选后，测定噬菌体滴度并随机挑取蓝色噬斑制备噬菌体原种用于鉴定。

1.2.2噬菌体克隆鉴定以pH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗LTA单抗至5 μg/ml，50 μl/孔，4℃过夜包被酶标板，0.25%酪蛋白37℃封闭2 h，0.5%PBST洗板3次后加入50 μl噬菌体原种上清或10倍系列稀释阳性噬菌体克隆No.2，37℃孵育40 min。0.5%PBST洗板10次，加入HRP-抗M13单抗(应用时1∶3 000稀释)，37℃孵育40 min，TMB室温避光显色，2 mol/L硫酸终止。以OD450nm值高于阴性对照3倍以上作为阳性噬菌体克隆。

1.2.3 DNA测序及序列分析扩增阳性噬菌体克隆，按常规方法提取噬菌体单链DNA。样品送上海英潍捷基公司测序。

1.2.4选择优势序列合成模拟LTA抗原表位的线性短肽选择与抗LTA单抗结合良好的No.2号所展示序列GHxDFRQxxQPS，委托深圳瀚宇有限公司合成线性肽L2(Biontin-HSGHxDFRQxxQPSGGGS )，HS、GGGS为两端起延长和支架作用的氨基酸残基。

1.2.5 ELISA鉴定LTA模拟短肽与抗LTA单抗结合特异性抗LTA单抗以碳缓(pH9.6)稀释，5 μg/ ml包被酶标条，4℃过夜。0.25%酪蛋白37℃封闭2 h后，依次加入系列稀释，生物素标记的线性肽L2(以1 mg/ml起始)，37℃孵育1 h后，加入HRP-链酶亲和素Streptavidin(1∶1 000稀释)，37℃孵育40 min，TMB室温避光显色，2 mol/L硫酸终止，测OD450nm。每个反应间均以0.05%PBST洗涤3次。

2　结果

2.1三轮液相筛选回收率以抗LTA单克隆抗体为靶标，采用液相筛选法筛选噬菌体12肽库。经3轮筛选，噬菌体富集率达300倍，富集效果明显(表1)。所得噬菌体克隆可用于鉴定。

2.2噬菌体克隆与抗LTA单抗特异性结合随机挑选45个噬菌体克隆进行鉴定，得到8个噬菌体克隆与抗LTA单抗结合(图1A)。选择其中与单抗结合最好的No.2号噬菌体克隆纯化，10倍系列稀释，ELISA鉴定其与抗LTA单抗结合，该克隆与抗体呈剂量依赖方式结合(图1B)。上述结果提示液相筛选可以获得模拟LTA表位的噬菌体克隆。

2.3阳性噬菌体克隆DNA测序及氨基酸序列推导

选择与抗LTA单抗结合良好的4个阳性噬菌体克隆送出测序，根据DNA序列推导出4条完全不同的氨基酸序列(表2)。

表1　液相法筛选噬菌体肽库回收率Tab．1 Measurement of recovery ratio after each round of solution-phase painning

Note: A.Positive phage clones bind to anti-LTA McAb specifically; B.Phage clone No.2 binds to anti-LTA McAb with a dose-dependent manner.

2.4线性肽L2与抗LTA单抗特异性结合基于No.2噬菌体克隆与抗LTA单抗结合，我们合成两条线性肽L2 (Biotin-HSGHxDFRQxxQPSGGGS)和L2-1(GHxDFRQxxQPSGGGS-己二胺-Biotin)。L2和L2-1核心序列(GHxDFRQxxQPS)均来自于No.2噬菌体克隆，为便于检测，分别将生物素标记在L2肽N端和L2-1肽C端，其中在L2-1肽和生物素之间加入己二胺(便于在合成肽C端交联生物素)。结果显示，L2与抗LTA单抗呈剂量依赖方式结合(图2A)，而在相同浓度下，L2-1不与抗LTA单抗结合(图2B)。上述结果提示L2模拟LTA表位。

表2　液相法筛选所得阳性噬菌体克隆氨基酸序列Tab．2 Amino acid sequences of positive phage clones screened by solution-phase biopanning

图2　线性肽L2与抗LTA单抗特异性结合Fig．2 Linear peptide L2 binds to anti-LTA McAb specifically

3　讨论

目前金葡菌疫苗研究难题之一在于该病原体致病因子众多，不同临床分离株所表达致病因子不同，而且不同致病因子在感染不同阶段表达。因此有必要选择多个稳定表达于细菌表面的分子构建多价疫苗。支持这一理论的是近期Bagnoli F.等构建五价疫苗免疫后可诱导体液免疫应答，并在不同感染模型中具有保护作用［9］。

我们选择金葡菌中保守性结构PGN和LTA作为疫苗研究候选，然而这两个分子均属于TI抗原，因其免疫原性弱而并不能成为疫苗。模拟肽可以作为糖脂类抗原替代物，免疫动物后可诱导记忆性免疫应答［18］，模拟肽疫苗候选已用于多种病原体实验性疫苗研究［19，20］。我们在前期工作中通过肽库筛选获得多条模拟PGN表位序列，根据其中一条序列合成四分支多价抗原肽MAP-P31，以此抗原肽作为免疫原免疫小鼠后，可保护小鼠抵御金葡菌感染［21］。在此基础上，本研究以抗LTA单抗为靶标筛选噬菌体肽库以期获得模拟LTA表位。为后续构建PGN模拟肽与LTA模拟肽双价疫苗提供实验依据。

噬菌体肽库筛选包括固相法和液相法，前者以靶标蛋白直接包被后进行肽库筛选，方法简单;后者基于蛋白A/G株可结合靶标分子IgG，则采用先将IgG与肽库在液相中孵育，再通过与蛋白A/G结合后淘洗、去掉未结合噬菌体克隆。液相筛选法与固相筛选法相比优势在于避免得到非特异性吸附酶标板的克隆。我们曾尝试以固相法筛选噬菌体肽库，但回收率低，所得克隆中含非特异吸板克隆(数据未显示)。因此在本研究中我们采用液相筛选法，表1显示经三轮液相筛选，回收率逐轮提高;而且ELISA结果显示我们所获得阳性噬菌体克隆与LTA单抗结合，而不与酶标板反应(图1A)。上述结果说明液相筛选可行性。我们所关注的No.2克隆所展示序列GHxDFRQxxQPS与固相筛选所得阳性克隆仅相差一个氨基酸，根据其序列所合成L2肽与抗LTA抗体特异结合，提示该序列模拟LTA表位。这为后续构建双价合成肽疫苗提供实验数据。

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［收稿2015-05-26修回2015-07-10］

(编辑张晓舟)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．015

通讯作者及指导教师:刘北一(1969年－)，女，博士，副教授，硕士生导师，主要从事抗感染免疫和疫苗研究，E-mail: lbydodo@ 163．com。

作者简介:王湘豫(1989年－)，女，主要从事抗感染免疫研究，E-mail: wxyjj_47@ 163．com。

文章编号1000-484X(2015) 10-1366-04

文献标志码A

中图分类号R392.9